A la fin de la vie d’une cellule, différentes forces mécaniques permettent la séparation des chromosomes. Nos données préliminaires suggèrent l’existence d’un autre mécanisme provenant du centre du fuseau mitotique, non décrit dans l’embryon une cellule de C. elegans qui permettrait la séparation des chromosomes. Dans cette cellule, les microtubules kinétochoriens n’appliquent aucune force mécaniques sur les chromosomes durant l’anaphase. Il a été décrit que les chromosomes sont séparés grâce au déplacement des centrosomes via les forces de traction corticales. A l’aide de la microchirurgie laser dans les embryons une cellule de C. elegans, j’ai montré qu’en détruisant physiquement un ou deux centrosomes, les chromosomes continuent de se séparer, révélant l’existence d’une force de propulsion interne au fuseau mitotique (Nahaboo et al., 2015). En combinant la destruction de centrosomes et l’inactivation génétique, nous avons caractérisé les rôles de gènes favorisant ou freinant cette force de propulsion. J’ai observé que la kinésine-5, BMK-1, et le crosslinker MAP-65/SPD-1 freinent cette force de propulsion. Alors que dans d’autres espèces ces protéines favorisent la séparation des chromosomes. Nous avons remarqué que les protéines RanGTP et CLASP, favorisant de la nucléation et la polymérisation des microtubules, aident cette force de propulsion. Ces propriétés suggèrent que la polymérisation des microtubules au centre du fuseau est requise pour permettre la séparation des chromosomes durant la mitose.Par manque d’outils adéquats afin d’altérer la dynamique des microtubules, nous avons collaboré avec l’équipe de biochimistes du Dr. D. Trauner à Munich en Allemagne. Ils ont synthétisé la molécule photoactivable, Photostatin (PST), permettant la dépolymérisation des microtubules en quelques secondes (Borowiak et al., 2015). Entre 390 - 430 nm, PST est activé, dépolymérisant les microtubules, alors qu’entre 500 – 530 nm, PST est inactivé, permettant la polymérisation normale des microtubules. J’ai mesuré que la croissance des microtubules avec PST actif est absente dans des cellules Hela. J’ai montré que le cycle cellulaire dans l’embryon de C. elegans est arrêté localement en présence de PST actif. Nous avons alors montré que PST contrôle optiquement la dynamique des microtubules, in vitro, in cellulo et in vivo, de manière non invasive, rapide, locale et réversible. En résume, j’ai identifié une nouvelle force permettant la séparation des chromosomes à l’aide des approches moléculaires et biophysiques, et j’ai aidé à la caractérisation PST, un antimicrotubule photoactivable de manière locale et réversible. / In mitosis, different mechanical forces are involved in chromosome segregation. In C. elegans one-cell embryos, preliminary data suggest that an unknown mechanism, coming from inside the mitotic spindle, could influence chromosome separation. In those cells, it has been showed that kinetochore microtubule activity is absent. Thanks to external pulling forces, centrosome separation drives chromosome segregation. By using microsurgery inside the one-cell C. elegans embryos, we have shown that destroying one or two centrosomes did not prevent chromosome separation, revealing the existence of an outward pushing force (Nahaboo et al., 2015). By combining gene inactivation and centrosome destruction, we showed that the kinesin-5 and the crosslinker SPD-1 act as a brake on this pushing force, whereas they enhance chromosome segregation in other species. Moreover, we identified a novel role for the two microtubule-growth and nucleation agents, RanGTP and CLASP, in the establishment of the centrosome-independent force during anaphase. Their involvement raises the interesting possibility that microtubule polymerization of midzone microtubules is required to sustain chromosome segregation during mitosis. Then, we aim to reversibility affect microtubule dynamics in the central spindle. Because of the lack of adequate tools, we have collaborated with biochemists from Dr. D. Trauner lab, in Munich, Germany, who are specialized in photoactivable drugs. They have synthetized a photoswitable drug, Photostatin (PST), which can depolymerize microtubules in few seconds in an on/off manner (Borowiak et al., 2015). Under blue light (390 - 430 nm), PST is activated leading to microtubule depolymerization, whereas under green light (500 - 530 nm), PST is activated which does not affect microtubule dynamics. I measured that microtubule growing is absent in presence of activated PST in Hela cells. I also showed that cell cycle can be stopped thank to activated PST in multiple cell C. elegans embryos. We have shown that PST can control microtubule dynamics thanks to visible light in vitro, in cellulo and in vivo, as an on/off switch, in a non-invasive, local and reversible manner.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016LYSEN003 |
| Date | 24 March 2016 |
| Creators | Nahaboo, Wallis |
| Contributors | Lyon, Delattre, Marie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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