Neospora caninum é um parasita intracelular obrigatório pertencente ao filo Apicomplexa, conhecido por ser uma das principais causas de aborto parasitário em bovinos e por apresentar transmissão transplacentária. Para locomoverem-se e acessarem o conteúdo intracelular de células hospedeiras, organismos apicomplexas fazem uso de um mecanismo não convencional que se utiliza de uma maquinaria celular cujo papel central é exercido pelo motor actina-miosina, auxiliado por proteínas intermediárias e de acoragem, que realiza a propulsão do parasita na direção do movimento. Para o funcionamento dessa maquinaria, é essencial que actina esteja em sua forma filamentosa (actina-F). Porém, actinas de apicomplexas são conhecidas por serem funcional e estruturalmente não convencionais, formando filamentos pequenos e instáveis in vitro, assim como pelo predomínio de grande maioria de actina monomérica (actin-G) nas células in vivo. Desse modo, para formar e manter actina-F a dinâmica de actina desses organismos requer uma regulação precisa, que, em apicomplexas, é conduzida por um arsenal conhecidamente pequeno de proteínas que se ligam a actina (ABPs). Nosso objetivo neste estudo foi identificar e caracterizar ABPs de N. caninum. Para isso, duas ABPs de N. caninum foram estudadas: fator de despolimerização de actina (NcADF) e proteína associada a ciclase (NcCAP); também, foi gerado e caracterizado soro contra região de actina de N. caninum entre aminoácidos 201 e 310 (anti-NcAct201-310). NcADF (correspondente ao acesso NCLIV_012510 em ToxoDB) foi submetida a caracterização molecular e bioquímica. A sua estrutura terciária foi gerada por modelagem molecular baseada em homologia, apresentando folding conservado, porém com F-loop de menor tamanho, quando comparada a ADF/cofilinas canônicas. A forma recombinante de NcADF foi expressa E. coli BL21 por plasmídeos pET32a(+) e pET28a(+) e solubilizada em tampão desnaturante e nativo, respectivamente. NcADF_pET32 foi purificada e utilizada para geração de soro anti-NcADF, que detectou ambas NcADF recombinantes, assim como proteínas endógenas em western blot 1-D e 2-D com peso molecular e pI próximos aos preditos. O soro anti-NcADF também localizou NcADF difusa no citoplasma, com menos intensidade nos polos de taquizoítas de N. caninum extracelulares. NcADF_pET28 foi purificado na forma nativa e utilizado para caracterização funcional para avaliação de seu papel na dinâmica de actina liofilizada de coelho. Ensaios de cossedimentação, cinética de polimerização e despolimerização, viscosimentria de baixo cisalhamento (queda de bola), estado estacionário e ligação entre actina-G e NcADF, em conjunto, mostraram que NcADF causa despolimerização de actina-F, realiza sequestro de monômeros de actina e quebra de filamentos. NcCAP foi submetida a caracterização molecular e foi identificada como produto de expressão do gene de acesso NCLIV_054140. NcCAP recombinante foi expressa em pET32a(+) e pET28a(+) predominantemente em corpos de inclusão e foi solubilizada em tampão desnaturante. A forma purificada de pET32_NcCAP, identificada por espectrometria de massas, foi utilizada para imunização e o soro resultante detectou NcCAP recombinante e endógena por western blot 1-D e 2-D, apresentando bandas e spots de peso molecular e pI próximos ao esperado. O soro anti-NcCAP também localizou NcCAP em taquizoítas ii extracelulares de N. caninum difusa no citoplasma e/ou com predomínio na região periplasmática da célula. Por fim, o soro anti-NcAct201-310 foi gerado, sendo capaz de detectar proteínas em sua forma nativa e realizar marcação na região periférica e, possivelmente, nuclear de taquizoítas de N. caninum extracelulares. A caracterização de ABPs de N. caninum feita neste trabalho amplia o conhecimento sobre a conservação dessas proteínas ao longo do filo Apicomplexa. Ademais, representa uma contribuição para o entendimento da dinâmica de actina e, por consequência, futuramente, pode colaborar para a elucidação de mecanismos-chave para a sobrevivência e disseminação dos parasitas pelo seu hospedeiro / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite that belongs to the phylum Apicomplexa. It is known as one of the main causes of infectious abortion in cows and for its efficient transplacentary transmission. Apicomplexan organisms use a phylum-specific mechanism of invasion and gliding motility, which use an unusual cellular machinery based on an actin myosin motor assisted by intermediary and anchoring proteins that creates the traction force to impulse the parasite forward. Filamentous actin (F-actin) is essential to the appropriate functioning of this machinery, although apicomplexan unconventional actin forms small and unstable filaments in vitro and is found preponderantly as monomer (G-actin) in cells. Thus, the parasites need actin-binding proteins (ABPs) to strictly regulate actin dynamics and to form and maintain F-actin when it is necessary to the cell. Here, we aimed at identifying and characterising ABPs from N. caninum. Two ABPs were characterised: actin-depolymerising factor (NcADF) and cyclase-associated protein (NcCAP) from N. caninum. In addition, a serum against the actin region between amino acids 201 and 310 (anti-NcAct201-310) was raised. NcADF, which corresponds to identification NCLIV_012510 on ToxoDB, was molecular and biochemically characterised. Firstly, the tertiary structure of NcADF was generated by molecular modelling based on homology. Comparing to canonical ADF/cofilins, NcADF presented a conserved folding, albeit its smaller F-loop. The recombinant form of NcADF was expressed in E. coli BL21 using pET32a(+) and pET28a(+) plasmids and solubilized in denaturing and native buffers, respectively. Polyclonal antibodies were raised in mice against purified NcADF_pET32, which was able to detect both forms of recombinant NcADF as well as proteins in 1-D and 2-D western blot with expected molecular weight and isoelectric point (pI). Additionally, NcADF was localised in extracellular N. caninum tachyzoites as a diffuse pattern on cytoplasm with less intensity in both poles. NcADF_pET28 was successfully purified in native form and used for functional characterisation to evaluate the role of recombinant NcADF on lyophilised rabbit actin dynamics. Together, co-sedimentation, polymerisation and depolymerisation kinetic, low shearing viscometry (falling ball), steady state, and G-actin and NcADF binding assays showed that NcADF was able to depolymerise actin-F, sequester actin monomers, and sever filaments. Moreover, NcCAP (identification NCLIV_054140) was also characterised. Recombinant NcCAP was expressed in pET32a(+) and pET28a(+) plasmids predominantly in inclusion bodies and was solubilised in denaturing buffer. NcCAP_pET32 was purified and identified by mass spectrometry. Then, the polyclonal antibodies against this recombinant protein was generated in mice. It was able to detect recombinant and endogenous NcCAP, presenting bands and spots in 1-D and 2-D western blot with molecular weight and pI quite near to the predicted ones. NcCAP was localised as a diffuse pattern on cytoplasm and/or predominantly on periplasmic regions of extracellular taclyzoites of N. caninum. Finally, the serum containing anti-NcAct201-310 polyclonal antibodies was raised in mice. It detected endogenous proteins mainly in native form and localised them on periplasmic and possibly nuclear region in extracellular N. caninum tachyzoites. The characterisation of N. caninum ABPs iv extends our understanding of these proteins conservation and their function throughout the Apicomplexa phylum. Furthrmore, it represents a contribution to the field towards the comprehention of actin dynamics and in the future might provide information for important mechanisms of dissemination and survival of the parasite at its host
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03072017-082155 |
| Date | 26 April 2017 |
| Creators | Baroni, Luciana |
| Contributors | Natsui, Ana Patricia Yatsuda |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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