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Previous issue date: 2016-01-26 / UNIEDU / FUMDES / T. evansi causes a highly pathogenic disease in horses
popularly known as "Surra" or "Mal das Cadeiras". The
Pantanal (Brazil) outbreaks are recorded due to the large
population of horses. To date there are no effective
treatment methods causing major damage to livestock.
Trypanosomes present themselves vulnerable in relation
to the metabolism of purines as these organisms do not
have the pathway “De novo” of meeting their
requirements through the rescue of preformed bases and
demonstrate complete dependence of purines of their
hosts. Among the components of this system point out
that adenosine has its concentration controlled by the
enzyme adenosine deaminase (ADA). The objectives of
this study were to amplify, clone and sequence the ADA
gene from T. evansi DNA samples and express the
recombinant protein ADA. The coding region of the ADA
gene was amplified from genomic DNA of T. evansi and
yielded a sequence of 1857 bp showed high degree of
similarity (95%) ADA T. brucei. This region was cloned
into the pGEM-T vector Easy®. After digestion of
construct pGEM: ADA fragments were cloned into
expression vector pET30. The expression analysis by
SDS-PAGE demonstrated that the temperature of 18ºC
for 24 hours and 0,05 mM IPTG induction was the most
effective indicating molecular mass of approximately
68 kDa. The Western blot analysis detected the ADA enzyme in the protein extract of T. evansi only in the
insoluble fraction. The protein was solubilized and
purified by affinity chromatography. Through these
results the presence of ADA in T. evansi was confirmed.
tests will be performed to detect the enzymatic activity of
ADA. Their study can contribute to the development of
new chemotherapeutic agents and the development of
specific inhibitors for the ADA / T. evansi causa uma doença altamente patogênica em
equídeos popularmente conhecida como “Surra” ou “Mal
das Cadeiras”. No Pantanal (Brasil) surtos são
registrados devido à grande população de equinos. Até o
presente momento não existem métodos de tratamento
eficazes gerando grandes prejuízos à pecuária. Os
tripanossomas apresentam-se vulneráveis em relação ao
metabolismo das purinas pois estes organismos não
contam com a via De novo satisfazendo suas exigências
por meio do salvamento das bases pré-formadas e
demonstram completa dependência das purinas dos
seus hospedeiros. Entre os componentes desse sistema
destacamos a adenosina que tem sua concentração
controlada pela enzima adenosina deaminase (ADA). Os
objetivos deste estudo foram amplificar, clonar e
sequenciar o gene ADA a partir de amostras do DNA de
T. evansi e expressar a proteína recombinante ADA. A
região codificadora do gene da enzima ADA foi
amplificada a partir do DNA genômico de T. evansi e
originou uma sequência de 1857 bp que apresentou alto
grau de similaridade (95%) com a enzima ADA de T.
brucei. Essa região foi clonada no vetor pGEM-T Easy®.
Após a digestão da construção pGEM:ADA, os
fragmentos foram clonados em vetor de expressão
pET30. A análise da expressão através do SDS-PAGE
demonstrou que a temperatura de 18ºC por 24 horas e
indução com IPTG 0.05 mM foi a mais eficiente
indicando massa molecular de aproximadamente 68 kDa. A análise Western-Blot detectou a enzima ADA no
extrato proteico de T. evansi apenas na fração insolúvel.
A proteína foi solubilizada e purificada por meio da
cromatografia de afinidade. SDS-PAGE e o Western-blot
confirmaram a eficiência destes protocolos. Através
desses resultados a presença da enzima ADA em T.
evansi foi confirmada. Seu estudo pode contribuir para o
desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos e o
desenvolvimento de agentes inibidores específicos para
ADA
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/2366 |
| Date | 26 January 2016 |
| Creators | Ribeiro, Cristina Alves |
| Contributors | Vogel, Carla Ivane Ganz |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado, UDESC, Brasil, UDESC::CAV |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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