Les oligosaccharides de chitine (COs) jouent des rôles majeurs chez les plantes. Alors que les COs longs (6-8 unités saccharidiques) sont des éliciteurs c’est-à-dire qu’ils activent leurs mécanismes de défenses vis-à-vis de microorganismes pathogènes, les COs courts (4-5 unités saccharidiques) participeraient à l’établissement de symbioses avec des microorganismes bénéfiques permettant une meilleure assimilation des nutriments du sol. Afin de mieux comprendre comment les plantes discriminent ces signaux moléculaires, il est nécessaire de disposer de molécules pures aux structures chimiques parfaitement contrôlées pour caractériser les récepteurs protéiques mis en jeu. Dans le cadre de cette thèse nous nous sommes intéressés à la synthèse de COs de degré de polymérisation contrôlé et leur modification pour obtenir de nouvelles sondes d’affinité. Pour cela un plan d’expérience a été développé afin d’optimiser la production de COs et plus particulièrement d’oligosaccharides longs par hydrolyse enzymatique de chitine avec une enzyme commerciale, le lysozyme du blanc d’œuf. Par la suite, un nouveau type de sonde d’affinité permettant le marquage spécifique de protéines affines des COs a été mis au point. Nous avons en effet montré pour la première fois que des glycosides de triazinyle peuvent être efficacement utilisés pour introduire un groupe fluorescent sur une protéine interagissant avec l’oligosaccharide sans aucune activation chimique ou physique extérieure. Après avoir démontré la preuve de concept avec des lectines, une sonde d’activité permettant de mesurer l’activité de chitinases par fluorescence et de réaliser leur marquage dans le même temps a été synthétisée. Ces nouveaux outils devraient permettre de progresser dans la caractérisation des récepteurs de COs chez les plantes mais également permettre à terme de découvrir de nouvelles protéines lectines ou enzymes qui interagissent avec les sucres. / Chitinoligosaccharides (COs) play major roles in plants. While long COs (6-8 saccharide units) are elicitors activating plant defense mechanisms against pathogenic microorganisms, short COs (4-5 saccharide units) would participate in the establishment of symbioses with beneficial microorganisms allowing better assimilation of soil nutrients. Identifying the receptors involved in these processes to understand how plants discriminate these signal molecules requires having access to pure molecules with well-defined degrees of polymerization. In this thesis, we focused on the synthesis of well-defined COs and their modification to obtain new affinity probes. For this purpose, a design of experiments was developed in order to optimize the production of COs and more particularly of long ones by enzymatic hydrolysis of chitin with a commercial enzyme, hen egg-white lysozyme. Subsequently, a new type of affinity-based probe allowing the specific labeling of CO-binding proteins has been developed. We have shown for the first time that triazinyl glycosides can be effectively used to introduce a fluorescent group on an oligosaccharide-binding protein without any external chemical or physical activation. After demonstrating the proof of concept with lectins, a fluorescent activity-based probe allowing continuous assay of chitinases and their labeling at the same time was synthesized. These new tools offer exciting perspectives for the characterization of CO receptors in plants as well as for the discovery of new lectins and carbohydrate-active enzymes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018GREAV054 |
| Date | 17 December 2018 |
| Creators | Masselin, Arnaud |
| Contributors | Grenoble Alpes, Fort, Sébastien |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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