Les microARN constituent une classe de petits ARN non codants d’une vingtaine de nucléotides, issus de transcrits cellulaires, qui inhibent l’expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel. Chez les mammifères, bien qu’ils puissent agir sur une cible parfaitement complémentaire (mode parfait), les microARN ont presqu’exclusivement des cibles partiellement complémentaires (mode imparfait). Puisqu’en mode imparfait une coupure endonucléolytique de la cible est impossible, il est généralement proposé que le mode imparfait soit moins efficace que le mode parfait : conduisant à un silencing moins efficace, nécessitant plus de complexes effecteurs (miRISC) et facilement saturable par une augmentation du nombre de cible. Dans ce travail j’ai développé une approche expérimentale reposant sur l’expression de protéines fluorescentes pour mesurer précisément le silencing au niveau de chaque cellule. J’ai fait trois observations inattendues sur l’efficacité de la régulation par les microARN : i) le silencing en mode parfait et imparfait nécessite des quantités similaires de petit ARN, ii) une augmentation, même très importante, de l’expression du gène cible ne lui permet pas d’échapper à la régulation, iii) le silencing n’est pas intrinsèquement plus faible en mode imparfait (qu’en mode parfait) mais n’est pas actif dans toutes les cellules. Si les deux premiers points sont facilement explicables dans le cadre de l’induction de la dégradation de l’ARNm cible sur un mode catalytique via la déadénylation de l’ARNm, le troisième indique l’existence d’une régulation forte du silencing qui est spécifique du mode imparfait. De plus, comme dans les deux modes le silencing dépend principalement du même partenaire, Ago2, cette régulation intervient après l’assemblage du complexe minimal (Ago2/petit ARN). Ainsi, les différences entre les modes parfait et imparfait ne se situent pas au niveau proposé puisque lorsque la cellule est compétente, leurs efficacités sont comparables. Par contre, mes travaux mettent en évidence l’existence d’un contrôle de la régulation en mode imparfait dont la nature reste à préciser. / MicroRNAs are endogenous small non-coding RNAs about 21 nucleotides in length that inhibit the expression of target genes primarily at the post-transcriptional level. The target recognition of microARN is sequence-specific and requires a partial complementarity between the microRNA and target sequences that are present on the mRNA molecules. microRNAs are part of an effector complex, miRISC, containing multiple proteins which can participate to a repression of translation and/or promotes destabilization of the target mRNA. The mechanism of microRNA silencing is not completely understood to date, but it is assumed that it is globally less potent than that of siRNA acting on perfect targets. By using fluorescent proteins expressing reporter plasmids and flow cytometry, we observed an efficient silencing by microRNA which does not require more active complexes than the perfect target silencing and cannot be easily saturated. This suggests that in cells in culture, microRNA silencing works in a catalytic manner leading to mRNA degradation. In addition, our data also indicates that the efficiency of microRNA silencing is variable among cells and can be almost completely abrogated under some conditions contrary to the siRNA silencing which is active in all cells. As we observed that the protein Ago2 is the only member of Ago family that is implicated in the microRNA silencing, it follows that the regulation of microRNA silencing acts after the formation of the core complex (Ago2/small RNA). So the difference between the silencing in the perfect and imperfect mode are not what is usually proposed, but pertain to a level of cellular control, which remains to be deciphered.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012PA11T094 |
| Date | 19 December 2012 |
| Creators | Huang, Lue |
| Contributors | Paris 11, Dautry, François |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, StillImage |
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