A incidência de infecções por fungos oportunistas na população de pacientes imunocomprometidos tem aumentado nos últimos anos, e estas são, principalmente, causadas por Candida albicans. Este patógeno oportunista pode crescer em diferentes formas, variando de levedura, pseudohifa e hifa e essa transição morfológica está associada com a virulência. Na transição de levedura para hifa, genes hifa-específicos são expressos e muitos deles codificam proteínas que possuem uma molécula de GPI (glicosilfosfatilinositol), mas a maioria (66%) das proteínas preditas ancoradas por GPI (PGAs), ainda possuem função desconhecida. Portanto, o objetivo deste trabalho, foi iniciar a caracterização funcional dos genes PGA13 e PGA58 através de análises in silico, da expressão diferencial dos RNAm sob condições ambientais diversas, e nos mutantes nulos TUP1 e EFG1, e a obtenção e caracterização fenotípica dos mutantes de PGA13: homozigoto nulo e de superexpressão. Os estudos realizados in silico indicam que PGA13 e PGA58 são reguladas pelos fatores transcricionais Efg1, Tec1 e Nrg1 e que possuem sítios potenciais de glicosilação. A análise transcricional desses genes mostra que ambos são regulados por Tup1 e que respondem aos estímulos NaCl (Cloreto de sódio), H2O2 (Peróxido de hidrogênio), etanol, cafeína, HCl (Ácido Clorídrico) e às condições hipo e hiperosmótica. Os mutantes nulos e de superexpressão de PGA13 e PGA58 foram obtidos e as linhagens que perderam o gene PGA13 tiveram um padrão de crescimento da colônia diferente da linhagem CAI-4 e foram mais sensíveis aos compostos SDS, Higromicina B e pH ácido, enquanto o mutante que superexpressava foi mais resistente. Estes resultados sugerem que Pga13 deve ter papel importante na parede celular, visto que a falta dela ocasionou maior sensibilidade a compostos que agridem a parede celular. / The incidence of opportunistic fungal infections in immunocompromised patients has increased in the last years. Candida albicans is the most commonly isolate in immunocompromised patients. C. albicans may grow in distinct morphologies: yeast, pseudohyphal and true hyphal. The switch between yeast and filamentous forms is strongly associated with virulence. During the transition, hyphal-specific genes are expressed and many of these genes encode glycophosphatidylinositol (GPI)- anchored proteins. The majority (66%) of predited GPI proteins has unknown functions. The purpose of this work was to functionally characterize the novel PGA13 and PGA58 genes. To accomplish this task, we have made in silico promoter analysis, mRNA differential expression analysis under some environmental conditions. We have also verified whether those genes are regulated by Tup1 and Efg1 transcriptional regulators. We have knocked out PGA13 and have done phenotypic analysis of the resulting PGA13 null mutant strain and a Pga13 overexpressing strain. The in silico promoter analysis indicates that PGA13 and PGA58 may be regulated by the transcriptional factors Efg1, Tec1 and Nrg1. PGA13 and PGA58 aminoacid sequence analysis revealed that they have potential glycosylation sites. The transcriptional analysis has shown that both genes are regulated by the morphogenesis negative regulator Tup1. PGA13 and PGA58 genes have differential expression in response to salt, hydrogen peroxide, ethanol, caffein, and acid stresses, and also to hypo and hyperosmotic shocks. The phenotypic analysis shows that the pga13/pga13 mutant was more sensitive to SDS, Hygromycin B and acid pH in a plate dilution sensitivity test. Interestingly, the overexpressing mutant strain was more resistant to the same compounds. Taken together these results suggest that PGA13 may have an important role in the cell wall since its absence leads to higher sensitivity to compounds that affect this organelle.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17122008-132351 |
| Date | 15 December 2008 |
| Creators | Fernandes, Fabrício Freitas |
| Contributors | Coelho, Paulo Sergio Rodrigues |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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