Die biologischen Grundlagen und sozioökonomischen Auswirkungen der Alzheimerschen Erkrankung (Alzheimer‘s Disease; AD) sind ein aktuelles Thema unserer immer älter werdenden Gesellschaft. Doch bis heute sind nicht alle pathophysiologischen Vorgänge erforscht, um diese Erkrankung in ihrer Ursache zu verstehen und damit Ansätze für eine adäquate Therapie zu ermöglichen. Eine weit verbreitete Theorie zur Krankheitsentstehung ist die Amyloid-Kaskaden-Hypothese, die ß-Amyloid (Aß)-Peptiden eine zentrale Rolle bei der Alzheimer-Pathogenese zuspricht. Diese Aß-Peptide entstehen durch proteolytische Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins (amyloid precursor protein; APP) und sind auch im Gehirn von nicht-dementen älteren Menschen nachweisbar. Neue Forschungsergebnisse legen nahe, dass bestimmte posttranslationale Modifikationen des Aß-Peptids zu verringertem Abbau, erhöhter Aggregation und gesteigerter Neurotoxizität beitragen. Eine solche besonders pathogene Aß-Variante ist Pyroglutamat-Aß (pE-Aß). Es entsteht durch N-terminale Verkürzung von Aß um zwei Aminosäuren und folgende Zyklisierung des N-terminalen Glutamats zu Pyroglutamat (pE). Eine Möglichkeit die Bildung, den Transport und die Ablagerung von pE-Aß im Gehirn verstorbener Alzheimer-Patienten und im Gehirn von Versuchstieren mit Amyloid-Pathologie zu untersuchen, ist die Verwendung spezifischer Antikörper.
Ziel dieser Arbeit war es, vier neue monoklonale Antikörper hinsichtlich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Gehirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie zu untersuchen.
Für diese Untersuchungen wurden transgene Mäuse des Stammes Tg2576 verwendet. Diese exprimieren humanes APP der neuronalen Isoform mit 695 Aminosäuren mit der sogenannten schwedischen Doppelmutation KM670/671NL. Diese Mutation sorgt dafür, dass APP ein besseres Substrat für die amyloidogene Prozessierung ist und verstärkt Aß gebildet wird. Tg2576-Mäuse entwickeln ab einem Alter von 11 bis 13 Monaten Alzheimer-typische Amyloidablagerungen im Neokortex und im Hippocampus. In der vorgelegten Arbeit wurden Mäuse im Alter von 16, 18 und 21 Monaten untersucht, um zu prüfen ob mit den neuen pE-Aß-Antikörpern die in anderen Arbeiten beschriebene Zunahme der Aß-Pathologie im Alterungsprozess dargestellt werden kann. Als Kontrollen wurden gleichaltrige Wurfgeschwister, die das Transgen nicht exprimieren, verwendet. Pro Altersstufe wurden zwei transgene Mäuse und ein Wildtyp-Tier untersucht.
Die vier neuen zu charakterisierenden monoklonalen pE-Aß-Antikörper wurden von der Firma Probiodrug AG, Halle/Saale zur Verfügung gestellt. Sie wurden durch Immunisierung von C57Bl6-Mäusen mit einem Hexapeptid aus dem N-Terminus von pE-Aß (Sequenz pEFRHDS) generiert. Diese vier monoklonalen Antikörper besaßen verschiedene IgG-Subtypen: Klon K6 (IgG1), Klon K17 (IgG2b), Klon K24 (IgG1), Klon F8 (IgG3). Vergleichend wurde ein pE-Aß-Antikörper der Firma Synaptic Systems (Klon 2-48) vom Subtyp IgG1 verwendet.
Auswahl der untersuchten Gehirne – „Gefäßhintergrund“. Durch ungleichmäßige Perfusion und Fixierung der Gehirne kann es zu einer unerwünschten Färbung von Blutgefäßen kommen, wodurch die Quantifizierung von Plaques erschwert wird. Um dies zu vermeiden wurden die Gehirne von 13 Mäusen hinsichtlich dieses Kriteriums mittels Immunhistochemie mit dem pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems untersucht und anschließend ausschließlich Tiere ohne oder mit sehr geringem Gefäßhintergrund verwendet.
Eignung der neuen monoklonalen primären pE-Aß-Antikörper. Es wurde eine Versuchsreihe angefertigt, um die immunhistochemischen Färbungen der vier neuen monoklonalen pE-Aß-Antikörper an Mäusegewebe zu testen und diese mit dem etablierten Synaptic Systems Antikörper zu vergleichen. Die Testreihe zeigte erwartungsgemäß, dass der Synaptic Systems pE-Aß-Antikörper, aber auch die neuen Antikörper K6, K17 und F8 eine gute, jedoch auch unterschiedlich intensive Plaquefärbung erbrachten. Der Antikörper K24 wurde aus den weiteren Versuchsreihen ausgeschlossen, da keine Plaquefärbung nachweisbar war.
Verdünnungsreihen der primären pE-Aß-Antikörper. Die verwendete Konzentration eines Antikörpers kann die Intensität der spezifischen Färbung, aber auch die Hintergrundfärbung stark beeinflussen. Deshalb galt es festzulegen, in welchen Verdünnungen die neuen primären pE-Aß-Antikörper zur Quantifizierung der Plaquefläche im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse eingesetzt werden sollten. Für jeden einzelnen Antikörper wurde eine Verdünnungsreihe (1:100; 1:250; 1:500) angefertigt und die Verdünnung bestimmt, welche die beste immunhistochemische Visualisierung der Aß-Ablagerungen ermöglicht. Dies war für den Klon K6 1:100, für Klon K17 1:250 und für Klon F8 1:250.
Verwendung geeigneter Sekundär-Antikörper. Kommerziell verfügbare Sekundär-Antikörper gegen Maus-IgGs erkennen entweder alle IgG-Subytpen, oder sind gegen einzelne IgG-Subtypen gerichtet. Um geeignete Sekundär-Antikörper zum Nachweis der pE-Aß-Antikörper für die Plaque-Darstellung zu identifizieren, wurden verschiedene Verdünnungen (1:200 und 1:400) von nicht-Subtyp-spezifischen und von Subtyp-spezifischen biotinylierten Esel-anti-Maus IgGs getestet. Dabei zeigte sich, dass in jedem Fall die biotinylierten subtypspezifischen sekundären Esel anti-Maus Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 die geringste Hintergrundfärbung und das deutlichste Signal erbrachten. Deshalb wurden nur diese für die folgenden Versuchsreihen eingesetzt.
Quantifizierung der Plaque-Beladung im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse. Um die Plaque-Beladung in definierten Hirnstrukturen APP-transgener Tg2576-Mäuse zu quantifizieren, wurden für jeden der vier untersuchten pE-Aß-Antikörper (Synaptic Systems, K6, K17 und F8) in drei Altersstufen (16, 18 und 21 Monate) in neun verschiedenen koronalen Schnittebenen immunhistologische Färbungen durchgeführt. Die Schnittebenen befanden sich auf Ebenen, die folgende Strukturen enthalten: 1 Präfrontaler Kortex, 2 Basales Vorderhirn, 3 anteriore Kommissur, 4 Nucleus basalis, 5 Hippocampus anterior, 6 Hippocampus posterior, 7 Locus coeruleus anterior, 8 Locus coeruleus posterior, 9 kaudaler Hirnstamm. Dies ermöglichte es, in verschiedenen Hirnregionen die Ablagerung von pE-Aβ während des Alterungsprozesses zu untersuchen. Es wurden für jede Hirnregion die aufeinanderfolgenden Schnitte für die vier primären Antikörper ausgewählt, sodass ein Maximalabstand von 120 µm zwischen den Färbungen der pE-Aß-Antikörper besteht, da jeder Schnitt eine Dicke von 30 µm aufwies.
Da je Altersstufe zwei Tiere analysiert wurden, ergeben sich pro Antikörper und Altersstufe 18 gefärbte und quantifizierte Schnitte, demzufolge resultiert pro untersuchtem Antikörper eine Gesamtzahl von 54 Schnitten. Die Gesamtzahl der ausgewerteten Schnitte dieser Arbeit beträgt 224.
Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms BZ-II-Analyzer, einer Analysesoftware des Digitalmikroskops Keyence. Durch eine Aufnahme des kompletten Hirnschnitts und Markierung der Plaquefläche konnte deren prozentualer Anteil an der Hirnschnittfläche bestimmt werden.
Betrachtet man die vier Antikörper untereinander, wird erkennbar, dass der pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems in jeder Altersstufe die größte Plaquefläche darstellt. Die pE-Aß-Antikörper K17 und F8 zeigen eine geringere und untereinander ähnliche Plaquefläche. Der K6 Antikörper weist die geringste Plaquefläche nach.
Im Altersgang ist für alle untersuchten pE-Aß-Antikörper eine Zunahme der markierten Plaquefläche nachweisbar.
Die untersuchten Gehirnschnittebenen sind unterschiedlich stark von pE-Aß-Ablagerungen betroffen. Die am weitesten rostral gelegene Schnittebene mit präfrontalem Kortex weist besonders viele pE-Aß-Ablagerungen auf, während die darauf folgende Schnittebene deutlich weniger pE-Aß-Ablagerungen zeigt. Danach gibt es Richtung kaudal wieder eine Zunahme der pE-Aß-Ablagerungen. In den Schnittebenen 7, 8 und 9 wurden keine pE-Aß-Ablagerungen nachgewiesen.
Doppelmarkierungen von pE-Aß-Antikörpern verschiedener IgG-Subtypen und mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8. Um nachzuweisen, ob alle untersuchten pE-Aß-Antikörper dieselben Strukturen darstellen, wurde eine Versuchsreihe mit Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen angefertigt. Obwohl die primären monoklonalen pE-Aß-Antikörper alle in der Maus generiert wurden, erlaubten die verschiedenen IgG-Subtypen eine Doppelmarkierung mit Subtypen-spezifischen Sekundärantikörpern. Dabei zeigte sich, dass alle pE-Aß-Antikörper dieselben Anteile von Aβ-Ablagerungen erkennen. Um nachfolgend zu zeigen, welche Anteile der Aβ-Ablagerungen von den pE-Aβ-Antikörpern erkannt werden, wurden Doppelmarkierungen der verschiedenen pE-Aß-Antikörper mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8 angefertigt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die pE-Aβ-Peptide im Zentrum der Aβ-Ablagerungen befinden.
In dieser Arbeit konnten vier neue monoklonale Antikörper bezüglich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Hirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie charakterisiert werden. Während der Klon K24 für die Plaquedarstellung ungeeignet ist, wurden für die Klone K17 und F8 vergleichbare, wenn auch geringere Plaqueflächen nachgewiesen als für den kommerziell verfügbaren Antikörper von Synaptic Systems. Der pE-Aß-Antikörper K6 markierte die geringste Plaquefläche. Dies könnte auf eine höhere Spezifität oder auf eine geringere Sensitivität von K17, F8 und K6 gegenüber dem Synaptic Systems Antikörper zurückzuführen sein.
Mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen pE-Aß könnte es möglich sein, einen Impfstoff zu entwickeln, der gegen eine besonders toxische Aβ-Peptid-Variante gerichtet ist. Eine Immunisierung im Frühstadium der AD würde zwar nicht die Erkrankung in ihrem Ursprung heilen, könnte aber deren Verlauf verlangsamen.
Zudem ist es denkbar, spezifische Antikörper gegen besonders neurotoxische pE-Aß-Varianten für die klinische Diagnosestellung zu etablieren.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-223936 |
| Date | 04 May 2017 |
| Creators | Dušek, Katarina |
| Contributors | Universität Leipzig, Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung, Professor Dr. rer. nat. habil. Steffen Roßner, Prof. Dr. med. Thomas Arendt, Prof. em. Dr. med. Ralf Schober |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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