Septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina que atuam no ciclo de divisão celular e também são amplamente encontradas em doenças neurodegenerativas tais como mal de Parkinson e Alzheimer e em alguns tipos de câncer como leucemia, linfoma e tumores sólidos. Neste trabalho investigamos como a temperatura e a concentração impactam na agregação do domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G), podendo levar a formação de bras amilóides, por espalhamento de luz (DLS) e Raios-X a baixos ângulos (SAXS). Resultados de DLS revelaram que a cinética de agregação da proteína é da ordem de segundos para temperaturas maiores que 25ºC. Os dados de SAXS da proteina a 0,5 mg/ml mostraram que a SETP2G é um dímero em solução aquosa a 4ºC e esta conguração se mantém estável por cerca de 1 hora de observação experimental. A 15ºC, os resultados de SAXS revelaram uma coexistência de três populações em solução compostas por 88% de dímeros, 10% de agregados pequenos tipo-cilindros (protobrilas), e 2% de agregados grandes maiores que a resolução da técnica. Após cerca de 30 minutos existe um rearranjo preferencial de dímeros em favor de agregados muito grandes cuja contribuição à curva de espalhamento torna-se 8%. A 25ºC, a porcentagem de dímeros decresce para 70% com uma contribuição de cerca de 30% de agregados grandes já no início das medidas experimentais. Nas temperaturas de 37ºC e 45ºC, dímeros e agregados muito grandes coexistem em solução desde o início das medidas experimentais, cujo equilíbrio se desloca rapidamente tal que após 20 minutos de observação a solução é composta majoritariamente por agregados muito grandes, identicados como estruturas amilóides pela técnica de uorescência da tioavina, que se intercala em estruturas cross-. A 1 mg/mL e temperatura de 4ºC, a proteína permaneceu estável durante cerca de 1 hora de observação sendo que existe um equilíbrio de dímeros (93%) com agregados alongados (contendo cerca de 80 monômeros) em solução. Com o aumento da temperatura para 15ºC, a maioria da população ainda é dimérica. Já a 25ºC, a presença de agregados muito grandes é bem significativa (da ordem de 30% coexistindo com dímeros e oligômeros). A 37ºC e 45ºC existe a formação de grandes agregados similar ao observado para a SEPT2G a 0,5 mg/mL. Em suma, os resultados de SAXS demonstraram que a SEPT2G tem uma cinética muito rápida de agregação a temperatura siológica, acentuada com o aumento de concentração da proteína em solução. / Septins are proteins from the GTP-binding family and participate in cell division cycle performing functions such as secretion and cytoskeletal division. They can also be found in neurodegenerative conditions as Alzheimer\'s and Parkinson\'s diseases and some kinds of cancer as leukemia, lymphoma and solid tumors. In this work, we investigated the influence of temperature and concentration on the septin 2 GTPase domain (SEPT2G) aggregation using dynamic light scattering (DLS) and small angle x-ray scattering (SAXS). DLS results revealed the protein aggregation kinetic is around seconds for temperatures above 25ºC. SAXS data of the protein at 0.5 mg/mL showed that SEPT2G is a dimer in aqueous solution at 4_C and this condition is kept stable for approximately one hour of experimental observation. At 15ºC, SAXS results revealed the coexistence of three populations in solution composed by 88% of dimers, 10% of cylinder-like smaller aggregates (protofibrils) and 2% of aggregates bigger than the technique detection. After 30 minutes there is a preferential rearrangement of dimers into very large aggregates which contribution on the scattering curve becomes 8%. At 25ºC, the dimers percentage decreases to 70% with a contribution of circa 30% of bigger aggregates, even at the beginning of data acquisition. At temperatures of 37ºC and 45ºC, dimers and very large aggregates coexist in solution since the beginning of data acquisition, which equilibrium quickly shifts in such a way that after 20 minutes of observation the solution is mostly composed by very large aggregates, indented as amyloid structures by the thioflavine fluorescence technique, which intercalates in the cross- structures. At 1 mg/mL and 4ºC, the protein was stable over 1 hour of observation where an equilibrium of dimers (93%) and elongated structures (composed by approximately 80 monomers) in solution takes place. Increasing the temperature to 15ºC, most of the protein remains dimeric. On the other hand, at 25ºC the very large aggregates contribution is around 30% coexisting with dimers and oligomers. At 37ºC and 45ºC there is the formation of large aggregates, similar to what was observed at 0.5 mg/mL. In conclusion, our SAXS results indicated that the aggregation process of SEPT2G in solution may follow different pathways depending on concentration and temperature.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06082012-170235 |
| Date | 02 April 2012 |
| Creators | Sales, Elisa Morandé |
| Contributors | Itri, Rosangela |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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