O uso de genes em terapias é um conceito originado em 1970 em consequência do crescimento exponencial de novas tecnologias para liberação de DNA, também pela capacidade de expressão de genes exógenos em células de mamíferos. Propomos, então, a síntese de polímeros catiônicos, em dois grupos, por meio da aminólise da poli(succinimida) (PSI): grupo 1An, polímeros catiônicos com arcabouço poli (ácido aspártico) com cadeias laterais contendo aminas protonáveis; grupo 2An, polímeros catiônicos anfifílicos, contenho o poli (ácido aspártico) como arcabouço, com aminas protonáveis e cadeias dodecilamina. Estudos de SEC mostraram que derivados dodecilados 2An tiveram tamanho menor que os polímeros do grupo 1An, não dodecilados. A capacidade tamponante para todos os polímeros sintetizados foi maior que o bPEI 25, e o grupo 2An apresentou as maiores capacidades tamponantes. Derivados 2An com as aminas A1 a A4 apresentaram menor CMC do que o grupo 1An. Citotoxicidade dos policátions foi dependente das suas concentrações e, entre todos os polímeros, aqueles com aminas A5 e A6 não foram citotóxicos. A presença da cadeia dodecilamina na PSI não diminuiu a viabilidade celular até 250 ?L-1, sugerindo que a porção hidrofóbica não é citotóxica na faixa de concentrações testada. A complexação do pEGFP-N3 com os derivados de PSI foi realizada, bem como a transfecção dos poliplexos em células HeLa. A expressão de GFP dos complexos obtidos com bPEI 25 foi quantificada e comparada com os poliplexos preparados com os derivados da PSI. Ensaios de transfecção mostraram que os derivados dodecilados da PSI apresentaram expressão negligenciável de GFP em células HeLa, sugerindo uma ligação forte entre plasmídeo e os derivados sintetizados e não-liberação do material genético nas células, ou dano celular causado pela cadeia hidrofóbica nas células. Os maiores valores de GFP quantificados foram encontrados nos poliplexos contendo polímeros não-dodecilados e com as aminas A3 e A4, nas razoes N:P 5 a 20 para A3 e N:P 5 para A4. Ambas as estruturas A3 e A4 fazem parte do core do bPEI 25. / Genes as drugs for human therapy is a concept originally conceived around 1970, a consequence of the exponential growth in knowledge of human gene function, the more effective technologies for DNA delivery, and the ability to transfer and express exogenous genes in mammalian cells. Here we propose synthesizing two small library groups of cationic polymers via aminolysis of poly(succinimide) (PSI) backbone: group 1An, polycationic polymers with a degradable amide of poly(aspartic) acid backbone, protonable oligoamine side chains into the main polymer structure, and group 2An, amphiphilic cationic polymers with a degradable amide of poly(aspartic) acid backbone, protonable oligoamine side chains into the main polymer structure and dodecyl side chain moieties. SEC showed that dodecylated derivatives 2An had lower size than 1An group, non-dodecylated polyelectrolytes. Buffering capacity of all synthesized polymers was higher than the standard bPEI 25, and the dodecylated 2An group had the highest buffering capacities values. 2An derivatives with amines A1 to A4 showed lower CMC than their non-dodecylated pairs. Cytotoxicity of all polycations was dependent on the concentrations, and among all polymers, those with amines A5 and A6 had lower cytotoxicity than bPEI 25. Moreover, the presence of the hydrophobic dodecyl side chain in the PSI backbone did not decrease the cell viability until 250 ?g mL-1 polymer concentration, thus suggesting the hydrophobic moiety is not cytotoxic in this range. Complexation of pEGFP-N3 plasmid with PSI derivatives grafted with amines A1 to A4 was performed, as well as the transfection of polyplexes into HeLa cells. GFP expression of bPEI25 polyplexes in different complex volumes was quantified and compared with PSI derivatives/pEGFP-N3 polyplexes. Transfection assays showed that dodecylated PSI derivatives had negligible or no GFP expression in HeLa cells, thus suggesting a strong interaction between polycations and pDNA or a cellular damage caused by the hydrophobic moiety, although cytotoxicity assay of polyplexes showed low cytotoxicity of polyplexes. The highest GFP expression values were found for polycations 1A3 and 1A4, both without the dodecylamine side chain, in the N:P ratios 5 to 20 for 1A3, and N:P ratio 5 for 1A4. Both amines A3 and A4 used for the PSI grafting are core structures of bPEI 25.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-27052019-093239 |
| Date | 26 January 2018 |
| Creators | Kravicz, Marcelo Henrique |
| Contributors | Bentley, Maria Vitoria Lopes Badra |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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