O fator CIITA é a proteína responsável por controlar a transcrição de genes do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) envolvidos na apresentação antigênica a linfócitos T CD4+. A expressão desta proteína é complexa e célula-específica, dependendo de mecanismos de regulação transcricionais e póstranscricionais. Com o intuito de investigar o potencial do fator CIITA como adjuvante molecular, no presente estudo desenvolvemos e validamos sistemas de transferência gênica capazes de promover a eficiente expressão de CIITA em vários tipos celulares. Além disso, investigamos a regulação pós-traducional deste fator em células não hematopoéticas. Desta forma, foram produzidos um vetor plasmidial e um vetor lentiviral, ambos carreando a sequência do fator CIITA humano desenhada in silico visando a eliminação de elementos cis-reguladores, e otimizada para eficiente expressão em células humanas. A transfecção/transdução de três linhagens de células humanas não hematopoéticas resultou na eficiente expressão de CIITA com localização nuclear apropriada. Células expressando CIITA apresentaram síntese de novo do MHC II, confirmando a funcionalidade da proteína e validando ambos os vetores para a análise futura da atividade adjuvante do CIITA em imunizações gênicas. Ensaios preliminares de inoculação de explantes de pele humana com o vetor lentiviral evidenciaram a eficiente transdução e expressão do CIITA exógeno em células primárias. Em seguida, células dendríticas (DCs) derivadas de monócitos de indivíduos saudáveis ou infectados com HIV-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral para confirmar a expressão do CIITA em células primárias e avaliar a aplicação desse sistema adjuvante no aprimoramento da vacina de DCs anti-HIV. DCs de indivíduos saudáveis ou infectados foram transduzidas com sucesso pelo lentivírus, o qual induziu uma produção prolongada do mRNA codificando CIITA. Entretanto, os vetores lentivirais induziram um aumento inespecífico da expressão de marcadores fenotípicos das DCs, incluindo as moléculas do MHC II, o que impediu a avaliação indireta da expressão e atividade do fator CIITA através da detecção da expressão aumentada do MHC II. Ensaios futuros irão avaliar se o fator transcricional é expresso pelas DCs transduzidas ou se essas células apresentam um controle mais restrito da expressão do CIITA comparadas às linhagens celulares avaliadas. Interessantemente, ensaios de western blot comparativos entre as três linhagens de células humanas transfectadas/transduzidas, juntamente com ensaios de inibição da degradação protéica pelo inibidor do proteassoma, nos permitiu descrever um novo mecanismo de regulação pós-traducional do CIITA. Aqui, nós identificamos que cada tipo de célula não hematopoética mantém níveis específicos da proteína, e portanto, da sua atividade transcricional, através da regulação da degradação do CIITA pelo proteassoma. Essa regulação é mediada pela modulação dos níveis das proteínas da leucemia promielocítica (PML) acopladas a proteínas SUMO (modificadores pequenos similares à ubiquitina), modificação pós-traducional requerida para a interação PML-CIITA que impede a degradação pelo proteassoma. Esse novo mecanismo aqui descrito contribui para o entendimento ainda incipiente da regulação pós-traducional do fator CIITA em células não hematopoéticas e pode ter implicações importantes na aplicação dessa proteína como adjuvante molecular para imunoterapias / The CIITA factor is a protein responsible for controlling the transcription of major histocompatibility complex class II (MHC II) genes involved on antigen presentation to CD4+ T helper cells. The expression of this transcription factor is complex and differs in various cell types depending on transcriptional and post-transcriptional regulatory mechanisms. In order to investigate the CIITA factor potential as molecular adjuvant, here we developed and validated two gene delivery systems capable of promoting efficient CIITA expression in various human cell types. Additionally, we applied the delivery systems to investigate the post-translational regulation of this factor in nonimmune cells. A DNA plasmid and a lentiviral vector were produced, both carrying the human CIITA DNA sequence in silico designed to avoid cis-regulatory elements, and genetic optimized for expression efficacy in human cells. Transfection or transduction of three different non-immune human cell lines resulted in efficient CIITA expression with proper nuclear localization. The CIITA-expressing cells presented de novo MHC II molecules expression confirming the functionality of the exogenous protein, and validating both delivery systems for the future analysis of the CIITA adjuvant activity in genetic immunizations. Preliminary assays involving the inoculation of the lentiviral vector into human skin explants showed efficient transduction and expression of exogenous CIITA in primary cells. Next, monocyte-derived dendritic cells (DCs) from healthy individuals and HIV-1-infected patients were transduced with the lentiviral vector to confirm the exogenous CIITA expression in primary human cells and also evaluate the applicability of this adjuvant system to improve the DC-based vaccines against HIV. DCs from healthy and infected individuals were successfully transduced by the lentivirus, which induced a sustained CIITA mRNA production. However, the vector particles by themselves induced an unspecific upregulation of DC`s phenotypic surface markers, including the MHC II molecules, impairing our strategy to indirectly evaluate CIITA expression and activity through the detection of MHC II enhanced expression. Further investigations are necessary to confirm whether the transcription factor is efficiently expressed in transduced DCs or if these cells present a more restrict control of CIITA protein expression than the evaluated non-immune cells. Interestingly, western blot assays comparing the three human cell lines, transfected or transduced, along with inhibition of protein degradation by proteasome inhibitor treatments, allowed us to describe a new and intricate mechanism of CIITA post-translational regulation. Here we identified that each non-immune cell type maintain specific protein levels, and hence transcriptional activity, by modulating the rate of CIITA proteasomal degradation. This modulation is achieved by controlling the levels of Promyelocytic Leukemia (PML) proteins attached to Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) proteins, a post-translational modification required for the PML-CIITA interaction, which impairs the proteasomal degradation. This new mechanism described here contributes to the developing understanding of the CIITA post-translational regulation in non-immune cells, and might have important implications in the use of this transcription factor as a molecular adjuvant for immunotherapies
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24022016-153016 |
| Date | 04 December 2015 |
| Creators | Palma, Mariana de Lucena |
| Contributors | Duarte, Alberto Jose da Silva, Sumida, Telma Miyuki Oshiro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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