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Previous issue date: 2006 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. A infecção
por este organismo é freqüentemente diagnosticada pela determinação da presence de
anticorpos para a proteína M, imunodominante, mas o papel deste antígeno na patogênese da
histoplasmose permanence obscuro. A função do antígeno M não é conhecida, mas
geneticamente esta proteína é homologa catalases fúngicas.
Em nosso estudo, nós procuramos determinar regiões imunodominantes do antígeno
M, produzir um painel de anticorpos monoclonais contra esta proteína, caracterizá-los, usá-los
para o mapeamento de epítopos, mostrar a localização do antígeno M na levedura do H.
capsulatum, demonstrar a atividade de catalase desta proteína e desenvolver imunoensaios
para a detecção de anticorpos contra esta proteína e entígeno M circulante nos fluidos
corporais.
Foi possível determinar peptídeos com maior atividade antigênica e suas localizações
na molécula e caracterizá-los de acordo com as suas propriedades bioquímicas. Nós geramos
três fragmentos que continham estes peptídeos e os utilizamos para avaliar a ligação dos
anticorpos monoclonais e reconhecimento a cada fragmento separadamente. Um dos
fragmentos, F3, mostrou maior ligação aos anticorpos monoclonais que os outros avaliados,
entretanto estudos adicionais devem ser avaliados para um complete mapeamento. Para
avaliar o papel do antígeno M na patogênese da histoplasmose, usando análise por imunoblot
de um extrato de parede celular e membrana (CW/M) obtido de levedura, provamos que os
mAbs gerados contra o antígeno M recombinante puderam reconhecer este antígeno no
extrato utilizado. Estudos de imunofluorescencia também revelaram que os mAbs
reconheciam proteínas na superfície da levedura. Adicionalmente, avaliamos a atividade de
catalase usando diferentes frações celulares para sugerir a localização da enzima e
confirmamos que a maior atividade de catalase estava presente nos extratos incluindo
antígenos de superfície. A capacidade do antígeno M em funcionar como catalase sugere que
esta enzima está provavelmente envolvida na proteção pelas leveduras contra o stress
oxidativo na interior do fagolisossomo e escape dos mecanismos fungicidas nos macrófagos.
A localização do antígeno M na superfície do Hc tem importantes implicações na
antigenicidade da proteína já que está acessível ao sistema imunológico do hospedeiro e
interações com os anticorpos.
Adicionalmente, a ELISA para a detecção de anticorpos utilizando histoplasmina
purificada e tratada (ptHMIN) mostrou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de
96%, enquanto a ELISA para a detecção de antígenos mostrou uma sensibilidade de 80% e
uma especificidade de 91%, provando que estas duas metodologias poderiam ser utilizadas no
diagnóstico da histoplasmose. / Histoplasmosis is caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. Infection
with this organism is often diagnosed by determining the presence of antibody to the
immunodominant M antigen, but the role of the M antigen in the pathogenesis of
histoplasmosis has previously not been elucidated. The function of the M protein is not
known, but genetically it is homologous to fungal catalases.
In our work, we sought to determine immunodominant regions of the M antigen,
create a monoclonal antibodies panel, characterize them, use them for epitope mapping, show
that the M antigen was located on the cell surface of H. capsulatum yeasts, demonstrate the
catalase activity of the protein and developed an immunoassay to detect antibodies against
this protein and another one to detect the circulating M antigen in body fluids.
We could determine the peptides that have the most antigenic activity and their
localization on the molecule, and characterize according to biochemical properties. We
generated three fragments containing these peptides and used to evaluate the monoclonal
antibodies binding and recognition to each fragment. We could see that one fragment, the F3,
showed more binding to the mAbs than the other two, but additional studies have to be done
to complete the epitope mapping. To evaluate the role of the M antigen on the pathognesis of
histoplasmosis, using Western blot analysis of a detergent extract of cell walls and cell
membranes (CW/M) from yeast cells, we found that mAbs generated to recombinant M
antigen reacted with the CW/M preparations. Immunofluorescence studies also revealed that
the mAbs to the M antigen labeled the yeast cell surface. Also, we assayed the catalase
activity using different cell extract fractions for the localization of the enzyme and confirmed
that the major activity was present in extracts including fungal surface antigens. The ability
of the M antigen to function as a catalase suggests that this enzyme is probably involved in
protecting the yeast cells against the oxidative stress within the phagolisossome and escaping
of the fungicidal mechanisms in the macrophages. Localization of the M antigen to the cell
surface of Hc has important implications for the antigenicity of the protein since it
demonstrates that it is accessible to host immune cells and for antibody interactions.
Also, the ELISA for antibody detection using purified and treated histoplasmin
(ptHMIN) showed a sensitivity of 92% and a specificity of 96%, while the ELISA for antigen
detection showed a sensitivity of 80% and a specificity of 91%, proving that these two
methodologies could be used in the diagnosis of histoplasmosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/5661 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Guimarães, Allan Jefferson |
| Contributors | Simone, Salvatore Giovanni de, Soares, Célia Maria de Almeida, Rodrigues, Marcio Lourenço, Oliveira, Rosely Maria Zancopé, Peralta, José Mauro |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Allan Jefferson Guimarães, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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