The enzymatic conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars is a promising approach for producing renewable fuels and chemicals. However, the cost of the fungal enzymes usually employed in this process remains a significant bottleneck for manufacturing low value-added products from biomass. A potential route to increase hydrolysis yield, and thereby to reduce hydrolysis cost, would be to supplement the fungal enzymes with their lacking enzymatic activities, such as Beta-glucosidase. To produce such enzymes at a low cost, the bacterium Escherichia coli is a strong contender, owing to its ability to grow rapidly on simple and inexpensive media, and to achieve high levels of productivity. Nevertheless, there is hardly any techno-economic analysis of low-value protein production using E. coli in the literature, and, more generally, there are very few techno-economic analyses of low-value protein production ever reported, with the exception of cellulase production by Trichoderma reesei. In particular, the biotechnological application of recombinant E. coli platforms equipped with toxin-antitoxin systems to ensure plasmid stability remains largely unexplored, and its economic impact, unknown. As such, this work presents a comprehensive techno-economic analysis of the industrial production of a low-cost enzyme (Beta-glucosidase) using both E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, a modified BL21(DE3) strain equipped with a toxin-antitoxin system for plasmid maintenance. Moreover, this study describes the actual cloning and expression of a Beta-glucosidase enzyme into E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, and the development of a novel inoculum production scheme that exploits the features of the SE1 strain, based on repeatedly recycling a fraction of the inoculum cells. The results of the techno-economic analysis project an enzyme production cost of 316 US$/kg in the baseline scenario, which is considerably higher than the values reported in the literature for the fungal cocktails. The facility-dependent cost, which is strongly associated with the cost of equipment, accounts for roughly half of the estimated cost, while the cost of raw materials, especially IPTG and glucose, and the cost of consumables are all quite significant. However, the simulation of multiple scenarios and optimization measures suggest that the enzyme cost can be substantially reduced on many fronts, such as: substituting the carbon source for cheaper alternatives; reducing the amount of IPTG used for induction; using an E. coli strain capable of extracellular production; or eliminating the steps of concentration and stabilization of the enzyme, in the case of on-site enzyme utilization. Developing E. coli strains capable of high rEnzyme volumetric productivities can also significantly reduce the cost of the enzyme, up to approximately 135 US$/kg in the scenario of highest productivity. In addition, based on the experimental results with the E. coli SE1 system, an inoculum recycle strategy that avoids the need of an extensive seed train was simulated, resulting in a significant reduction of the enzyme cost. Finally, the combination of multiple process improvements could lead to an enzyme cost near 20 US$/kg of protein, which comes close to the cost of fungal cellulases and demonstrates the great biotechnological potential of recombinant E. coli platforms. / A conversão enzimática de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis é uma via promissora para a produção de combustíveis e produtos químicos renováveis. No entanto, o custo das enzimas fúngicas usualmente empregadas nesse processo permanece um gargalo significativo para a fabricação de produtos de baixo valor agregado a partir de biomassa. Uma possível estratégia para aumentar o rendimento da hidrólise e, assim, reduzir seu custo, seria suplementar as enzimas fúngicas com suas atividades enzimáticas deficientes, tais como a enzima Beta-glicosidase. Para produzir tais enzimas a um baixo custo, a bactéria Escherichia coli é uma forte candidata, dada a sua capacidade de crescer rapidamente em meios simples e baratos e de alcançar altos níveis de produtividade. No entanto, na literatura quase não há análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado utilizando E. coli e, de forma mais geral, há muito poucas análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado publicadas, com exceção da produção de celulases por Trichoderma reesei. Em particular, a aplicação biotecnológica de plataformas recombinantes baseadas em E. coli dotadas de sistemas toxina-antitoxina para garantir a estabilidade plasmidial segue em larga medida inexplorada, e seu impacto econômico, desconhecido. Assim, este trabalho apresenta uma análise técnico-econômica abrangente da produção industrial de uma enzima de baixo custo (Beta-glicosidase) usando E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, uma cepa de BL21 (DE3) modificada que possui um sistema toxina-antitoxina para manutenção plasmidial. Além disso, este estudo descreve a clonagem e expressão de uma Beta-glicosidase em E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, assim como o desenvolvimento de um novo método de produção de inóculo que tira proveito das peculiaridades da linhagem SE1, baseado em reciclar repetidamente uma fração das células do inóculo. Os resultados da análise técnico-econômica apontam para um custo de produção da enzima de 316 US$/kg no cenário-base, valor consideravelmente superior àqueles relatados na literatura para os coquetéis fúngicos. Os custos de overhead da planta, que estão fortemente associados ao custo de aquisição dos equipamentos, são responsáveis por aproximadamente metade do custo total, enquanto o custo de matérias-primas, especialmente IPTG e glicose, e o custo de consumíveis são bastante significativos. Porém, a simulação de múltiplos cenários e medidas de otimização sugerem que o custo da enzima pode ser substancialmente reduzido em muitas frentes, tais como: a substituição da fonte de carbono por alternativas mais baratas; a redução da quantidade de IPTG usado para indução; a utilização de cepas capazes de produzir a enzima extracelularmente; ou a eliminação das etapas de concentração e estabilização da enzima, em caso de utilização da enzima in situ. O desenvolvimento de cepas de E. coli capazes de atingir altas produtividades volumétricas de rEnzima também pode reduzir significativamente o seu custo, chegando a US$ 135/kg no cenário de maior produtividade. Com base nos resultados experimentais com a linhagem E. coli SE1, uma estratégia de reciclagem de inóculo que evita a necessidade de um extenso trem de inoculação também foi simulada, gerando significativa diminuição do custo da enzima. Por fim, a combinação de múltiplas melhorias no processo poderia levar a um custo de enzima em torno de 20 US$/kg de proteína, valor que se aproxima do custo das celulases fúngicas e que demonstra o grande potencial biotecnológico de plataformas de expressão baseadas em E. coli recombinante.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29052019-135103 |
| Date | 08 April 2019 |
| Creators | Ferreira, Rafael da Gama |
| Contributors | Azzoni, Adriano Rodrigues |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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