O presente projeto teve por objetivo a otimização das condições de cultivo do fungo endofítico Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. para incrementar a produção de metabólitos secundários com atividades antibacteriana, antifúngica, antiparasitária e antitumoral. O fungo foi cultivado em meio líquido em duas etapas distintas, primeiramente em 200 mL de meio pré-fermentativo de Jackson por 48 horas a 30 °C sob agitação constante (120 rpm), e posteriormente, reinoculando a massa micelial assepticamente obtida na etapa pré-fermentativa, em 400 mL de meio fermentativo Czapek, seguido de reincubação a 30 °C sob agitação constante (120 rpm). Após filtração do fluido da cultura e partição com solventes orgânicos obteve-se os extratos, aceto etílico, butanólico, etanólico e aquoso. A condição de cultivo padrão, cultivo inicial em meio fermentativo Czapek, foi realizada por 20 dias de incubação. Os extratos provenientes desta condição de cultivo foram avaliados quanto às atividades antibacteriana e antifúngica. O extrato aceto etílico apresentou, nesta condição de cultivo, a melhor atividade antibacteriana com concentração inibitória mínima (CIM) de 270 ?g/mL para Escherichia coli, não sendo observada atividade antifúngica nestes extratos. Após avaliação inicial foram realizadas modificações na condição de cultivo padrão em meio fermentativo, objetivando a otimização da atividade antibacteriana, anteriormente reportada. Avaliou-se as variáveis, período de incubação, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, pH, temperatura e proporção carbono/nitrogênio do meio, respectivamente. Cada variável foi aferida realizando ensaios de CIM dos extratos provenientes dos diferentes cultivos realizados, selecionando a melhor condição para a otimização da variável seguinte. A melhor condição para a produção de metabólitos secundários com atividade antibacteriana foi obtida em 9 dias de incubação utilizando-se sacarose (3,1%) como fonte de carbono e nitrato de sódio (0,1%) como fonte de nitrogênio, em pH 4 a 30 °C com valor de CIM de 90 ?g/mL para Escherichia coli e P. aeruginosa atividade esta superior a detectada sob a condição de cultivo padrão. Para a atividade antifúngica, anteriormente não detectada, a melhor condição de cultivo foi com a utilização de sacarose (3,1%) e nitrato de sódio (0,1%) em pH 4 a 30 °C para Aspergillus fumigatus (CIM de 130 ?g/mL) e sacarose (3,0%) e nitrato de sódio (0,2%), em pH 4 a 30 °C para Candida albicans ( CIM de 140 ?g/mL). A melhor condição de cultivo para a produção de metabólitos secundários com atividade antitumoral foi obtida com a utilização de sacarose (3,0%) como fonte de carbono e nitrato de sódio (0,2%) como fonte de nitrogênio, em pH 4 a 30 °C para as três linhagens tumorais humanas avaliadas (HCT-8, MDA-MB435 e SF295) nas quais detectou-se 100% de inibição de crescimento celular, esta condição foi também responsável pela melhor atividade inibitória da enzima APRT de L. tarentolae, apresentando 66,41% de inibição, indicando possível atividade antiparasitária. A otimização de condições de cultivo do fungo Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. mostrou-se relevante para a produção de metabólitos secundários bioativos. / The purpose of the current project was to optimize the conditions of culture of the endophytic fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. in order to increase the production of secondary metabolites with antibacterial, antifungal, antiparasitary and antitumor activities. The fungus was cultivated in a liquid medium in two different steps; first, in 200 mL of Jackson pre-fermentative medium for 48 hours at 30 °C, under constant agitation (120 rpm), and subsequently, reinoculating the mycelial mass aseptically obtained in the pre-fermentative step in 400 mL of Czapek fermentative medium, followed by reincubation at 30 °C under constant agitation (120 rpm). After filtration of the culture fluid and partition with organic solvents, the following extracts were obtained: acetyl ethylic, buthanolic, ethanolic and aqueous. The standard culture condition, initial culture in Czapek fermentative medium, was performed during 20 days of incubation. The extracts obtained from this culture condition were evaluated regarding the antibacterial and antifungal activities. The acetyl ethylic extract presented, in this culture condition, the best antibacterial activity, with a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of 270 ?g/mL for Escherichia coli; antifungal activity was not observed in this extracts. After the initial evaluation, modifications in the standard culture condition in fermentative medium were performed, aiming to optimize the previously reported antibacterial activity. The following variables were assessed: incubation period, carbon source, nitrogen source, pH, temperature and proportion of carbon/nitrogen in the medium. Each variable was evaluated using MIC assays of the extracts obtained from the different cultures performed, allowing the selection of the better condition for the variable optimization. The best condition for the production of secondary metabolites with antibacterial activity was obtained in 9 days of incubation, using sucrose (3.1%) as the carbon source and sodium nitrate (0.1%) as the nitrogen source, in pH 4 at 30 °C, with a MIC value of 90 ?g/mL for Escherichia coli and P. aeruginosa, which was superior to the activity detected under the standard culture condition. For the antifungal activity, previously undetected, the best culture condition was obtained using sucrose (3.1%) and sodium nitrate (0.1%) in pH 4 at 30 °C for Aspergillus fumigatus (MIC of 130 ?g/mL), and sucrose (3.0%) and sodium nitrate (0.2%), in pH 4 at 30 °C for Candida albicans (MIC of 140 ?g/mL). The best culture condition for the production of secondary metabolites with antitumor activity was obtained using sucrose (3.0%) as the carbon source and sodium nitrate (0.2%) as the nitrogen source, in pH 4 at 30 °C, for the three human tumor cell lines assessed (HCT-8, MDA-MB435 and SF295), in which 100% of cell growth inhibition was detected; this condition also accounted for the best inhibitory activity of the enzyme APRT of L. tarentolae, presenting 66,41% of inhibition, indicating possible antiparasitary activity. The optimization of the culture conditions for the fungus Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc. proved to be relevant for the production of bioactive secondary metabolites.
Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-19082008-180259 |
Date | 15 July 2008 |
Creators | Henrique Pereira Ramos |
Contributors | Suraia Said, Sérgio Ricardo Ambrosio, Fernando Batista da Costa |
Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
Language | Portuguese |
Detected Language | Portuguese |
Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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