Natürliche Killer T-Zellen stellen ein verbindendes Element zwischen angeborener und adaptiver Immunität dar und sind durch die Expression von T- und NK-Zell-Markern, sowie eines invarianten T-Zell-Rezeptors charakterisiert. Damit erkennen sie Lipide, welche vorwiegend durch dendritische Zellen mittels des MHC-I-ähnlichen Moleküls CD1d präsentiert werden. Die protektive Rolle von iNKT-Zellen bei Autoimmun- und malignen Erkrankungen ist nachgewiesen, ebenso ihre wichtige Aufgabe bei der Abwehr bakterieller, viraler und parasitärer Pathogene. Inwiefern iNKT-Zellen mit Pilzen und im speziellen Aspergillus fumigatus (A. f.) interagieren ist jedoch unzureichend beschrieben.
iNKT-Zellen gesunder Spender wurden ex vivo selektiv kultiviert und mit A. f. Konidien und Keimschläuchen kokultiviert. Microarray-Analyse, bzw. Multiplex-ELISA fanden Anwendung, um eine durch A. f. induzierte differentielle Genexpression bzw. Zytokinsekretion bei iNKT-Zellen zu detektieren. Zusätzlich wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen, ob A. f. die Produktion des TH1-Zytokins IFN-γ beeinflusst. Schließlich wurde der fungizide Effekt von iNKT-Zellen auf A. f. via XTT-Assay quantifiziert.
iNKT-Zellen zeigten einen ausgeprägten fungiziden Effekt auf A. f. Keimschläuche, welcher mit einem hohen Anteil IFN-γ+ iNKT-Zellen vergesellschaftet war. Hingegen zeigte sich kein Stimulus-spezifisches Zytokinsekretionsmuster. Besonders Keimschläuche induzierten eine differentielle Genexpression bei iNKT-Zellen. Diese war gekennzeichnet durch eine Hochregulierung von Genen des anaeroben Glukosemetabolismus. Als Zeichen einer möglicherweise lokalen Hypoxie waren VEGFA hoch-, bzw. CCL15 in ihrer Transkription herunterreguliert. Vor dem Hintergrund einer unbefriedigend hohen Mortalität der durch A. f. verursachten invasiven Aspergillose können diese ersten Ergebnisse der Interaktion des Schimmelpilzes mit iNKT-Zellen Grundlage für weitere Untersuchungen sein, um deren Wechselwirkung besser zu verstehen und möglicherweise zur Verbesserung der Therapie der Aspergillose beizutragen. / Objectives
Invariant human Natural Killer T Cells (iNKT-Cells) are innate immune effector cells. They are characterized by their expression of both, T- and NK cell markers and therefore they are a connecting link between innate and adaptive immunity. These cells are further defined by their T-Cell receptor, consisting of a specific, invariant α-chain and a β-chain derived from a limited repertoire. They strongly react upon stimulation with lipid antigens presented in the context of the MHC-like molecule CD1d on dendritic cells (DCs) and thus they can be expanded in vitro by stimulation with their prototypic agonist α-galactosylceramide (α-GalCer). A protective role of iNKT cells in autoimmune diseases and cancer immunity, as well as their action against different pathogens is well documented. However, little is known about their direct interaction with fungi, especially with Aspergillus fumigatus. A. fumigatus, an omnipresent mold, is the most prevalent cause of a highly devastating opportunistic infection, affecting mainly immunocompromised patients.
Methods
In order to expand human iNKT cells (iNKT⁺CD3⁺), PBMCs were treated with α-GalCer and rhIL-2 for 15-20 days. After expansion, purity of the iNKT+CD3+ fraction was >90%. To further purify this fraction, a positive selection with CD3 microbeads was performed. After that the purity increased above 95%. iNKT cells were cocultured with different morphologies of A. fumigatus, resting conidia and germlings. Gene induction was evaluated by microarray analysis (Affymetrix U219) and the protein release by using multiplex ELISA assays (BioRad Bio-Plex). Additionally, the induction of IFN-γ, a major Th1 cytokine, was analyzed by flow cytometry. Finally, XTT assays were used to examine the toxic effects of iNKT cells on A. fumigatus.
Results
Stimulating iNKT cells with different A. fumigatus morphologies, we observed a time- and morphotype-dependent induction of INF-γ, with germlings to be shown more immunogenic than conidia. Furthermore, challenging iNKT cells with A. fumigatus germlings at an MOI=1 for 6h, we found that iNKT cells caused a significant fungal damage. We could also observe defined patterns of gene induction, especially regarding cytokine and chemokine gene expression profiles. By multiplex ELISA assays gene expression patterns could be confirmed.
Conclusion
We found that there is a specific interaction of iNKT cells with A. fumigatus, leading to defined cytokine induction and a fungicidal effect. INF-γ, a cytokine, which has a known protective role against IA, is produced by iNKT cells when confronted with A. fumigatus.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:13483 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Gundel, Daniel |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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