Os frutooligossacarídeos (FOS) são oligômeros de frutose, cujas unidades frutosil estão ligadas na posição β-(2→1) na molécula de sacarose. Esses açúcares, de baixa caloria, são classificados com prebióticos, não são cariogênicos, podem ser usados por diabéticos, são de 0,4 a 0,6 vezes menos doce que a sacarose, sendo amplamente utilizados pelas indústrias farmacêutica e de alimentos como açúcares funcionais. Apesar dos FOS serem produzidos naturalmente por enzimas presentes em diversos vegetais, são disponibilizados comercialmente por meio da produção sintética, utilizando enzimas de origem microbiana como as frutosiltransferases (FTases, E.C.2.4.1.9) e sacarose como principal substrato. Diante deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a produção de FTases extracelular e micelial de Aspergillus oryzae IPT-301 por fermentação submersa aeróbia utilizando meio de cultura sintético, assim como a caracterização e estudos cinéticos das enzimas produzidas. Também foram investigados os efeitos da temperatura e pH do meio reacional nas atividades enzimáticas mediante técnica de planejamento experimental. Para a produção de FTases foi necessário o cultivo do micro-organismo em meio de cultura estéril e a fermentação foi conduzida em agitador orbital do tipo shaker. Com o caldo de fermentação filtrado e o micélio úmido foi possível determinar as atividades de transfrutosilação (quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de FOS por minuto nas condições experimentais) e hidrolítica (quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de frutose por minuto nas condições experimentais) extracelular e micelial, respectivamente, para as diferentes condições experimentais avaliadas. A concentração máxima de biomassa celular obtida foi de 9,35 ± 1,26 g.L-1 em 48 h de fermentação, sendo que em 76 h, houve a produção de 7,51 ± 1,57 g.L-1, período em que ocorreu a acidificação do caldo fermentado (pH 4,82). As condições nas quais a enzima extracelular obteve maior atividade de transfrutosilação foi aquela produzida em 64 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional de 50 °C, concentração de sacarose a partir de 296,0 g.L-1, apresentando estabilidade entre 30 e 35 ºC e em pH 6,0. Por outro lado, a FTase micelial mostrou sua máxima atividade quando produzida em 72 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional entre 45-55 °C, concentração de substrato igual a 470,6 g.L-1, indicando estabilidade para faixas de pH entre 6,0-8,0 e temperatura entre 30-40 ºC. A FTase extracelular apresentou cinética michaeliana em relação à concentração de substrato, exibindo valores de Vmax igual a 16,23 U.mL-1 e Km de 50,41 g.L-1 , enquanto a FTase micelial ajustou-se satisfatoriamente ao Modelo de Hill, cujos valores dos parâmetros Vmax, K0,5 e n foram iguais a 342,23 U.g-1 e 234,73 g.L-1 e 1,41, respectivamente. O estudo da influência do tempo e da temperatura reacional na síntese de FOS mostrou que a FTase extracelular produziu maior concentração de FOS a 50 °C, enquanto a FTase micelial a 40°C. A otimização do processo para a obtenção de FOS comprovou que a zona ótima da FTase extracelular (em que elevada atividade de transfrutosilação e baixa atividade hidrolítica são esperadas) ocorreu nas faixas de temperatura entre 45-50 °C e de pH entre 5,5-6,75. Para a FTase micelial, apenas a atividade de transfrutosilação ajustou-se satisfatoriamente ao modelo quadrático com interação, cuja zona ótima ocorreu em temperaturas superiores a 46 °C e valores de pH abaixo de 6,5. Os resultados obtidos atestaram que o fungo se destacou como fonte produtora de FTases e, estas, por sua vez, mostraram-se promissoras para a obtenção de FOS em escala laboratorial. / Fructooligosaccharides (FOS) are fructose oligomers in which the fructosyl units are bound in β-(2→1) position of sucrose molecule. These sugars, that present properties such as low caloric value and non-cariogenicity, are classified as prebiotics and can be used in diabetic products; they are 0.4 to 0.6 times less sweet than sucrose, being widely applied in the pharmaceutical and food industries as functional sugars. Despite the natural production of FOS by enzymes present in various vegetables, they are commercially available by synthetic production, using microbial enzymes such as fructosyltransferases (FTases, E.C.2.4.1.9) and sucrose as main substrate. In face of this context, the objective of the present study was the production of extracellular and mycelium FTases by Aspergillus oryzae IPT-301 from aerobic submerged fermentation using synthetic growth media, as well as the characterization of the enzymes produced and the conduction of kinetic studies. It was also investigated the temperature and pH effects of the growth media in the enzymatic activities through experimental planning. For FTases production was necessary the use of sterile growth media, and the fermentation was carried out in rotary shaker. With the filtered broth and the humid mycelium it was possible to determine the transfructosylation and hydrolytic activities of the extracellular and mycelium enzymes in different experimental conditions; the transfructosylation activity was defined as the amount of enzyme necessary to produce 1 µmol of FOS per minute under the experimental conditions, while the hydrolytic activity was defined as the amount of enzyme necessary to release 1 µmol of fructose per minute under the experimental conditions. The maximum biomass concentration (9.35 ± 1.26 g.L-1) was obtained in 48 h of fermentation; in 76 h there was a biomass production of 7.51 ± 1.57 g.L-1 and the acidification of the fermented broth (pH 4.82). The conditions in which was observed the maximum transfructosylation activity of the extracellular enzyme were 64 h of fermentation, pH range of 4.5 to 6.0, reactional temperature of 50 °C and sucrose concentration from 296.0 g.L-1; the thermal stability was between 30 and 35 °C and pH 6.0. On the other hand, mycelium FTase had its optimum in 72 h of fermentation, pH range of 4.5 to 6.0, reactional temperature between 45-55 °C and substrate concentration of 470.6 g.L-1; the thermal stability was between 30 and 40 °C and pH range 6.0 to 8.0. Extracellular FTase presented michaelian kinetic according to substrate concentration, showing Vmax and Km values of 16.23 U.mL-1 and 50.41 g.L-1, while micelial FTase fitted to Hill Model, whose Vmax, K0,5 e n values was 342.23 U.g-1 e 234.73 g.L-1 and 1.41, respectively. The study of reaction’s time and temperature showed that extracellular FTase produced a maximum concentration of FOS at 50 °C, while the micelial one at 40 °C. The process optimization for FOS production verified that the optimum zone for extracellular FTase, in which are expected high transfructosylation and low hydrolytic activities, occurred in temperature range of 45 - 50 °C and pH range of 5.5 - 6.75. For mycelium FTase, only the transfructosylation activity presented a satisfactory adjustment to the quadratic model with interaction, in which the optimum zone occurred in temperatures above 46 °C and pH values below 6.5. The results obtained showed that the fungus stood out as source of FTase, and these enzymes presented themselves as promising sources for FOS production in laboratorial scale. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/1022 |
| Date | 12 May 2017 |
| Creators | CUNHA, Josivan de Sousa |
| Contributors | PERNA, Rafael Firmani, http://lattes.cnpq.br/7591460969135629, MAIORANO, Alfredo Eduardo, http://lattes.cnpq.br/0612745177153409, MIRANDA, Everson Alves, HIRATA, Daniela Battaglia, TARDIOLI, Paulo Waldir |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Instituto de Ciência e Tecnologia, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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