Aspergilose Pulmonar Invasiva é uma doença fúngica oportunista, causada principalmente por Aspergillus fumigatus, que acomete pacientes imunodeprimidos. Para melhor compreensão dessa micose inicialmente estabelecemos em camundongos C57BL/6 um modelo experimental de depleção de neutrófilos por inoculação intraperitoneal de anticorpos anti-GR-1/Ly-6G, confirmado por contagem total e diferencial de leucócitos sanguíneos. A seguir, avaliamos a evolução da infecção pulmonar experimental utilizando duas amostras de A. fumigatus, caracterizadas previamente em fraca (amostra 699) e forte (amostra 1753) produtoras de elastase. Nenhum dos animais imunocompetentes e infectados evoluiu para o óbito, no período de 7 dias de observação. Os animais neutropênicos, infectados por ambas as amostras, apresentaram 100% de mortalidade após 5 dias, com curvas de sobrevivência praticamente sobrepostas, sugerindo que a maior contribuição para a virulência foi a condição imunológica e não a atividade de elastase da amostra fúngica. Para análise do comprometimento pulmonar, os animais foram sacrificados nos tempos 24, 48 e 72 horas pós-infecção. Durante a evolução da infecção experimental foi observada uma redução da carga fúngica nos pulmões dos animais, para ambas as amostras de A. fumigatus, mas não foi observada uma redução da carga fúngica, diferenciada e estatisticamente significativa, entre os grupos de animais neutropênicos e imunocompetentes. O padrão celular do infiltrado inflamatório observado nos pulmões dos animais neutropênicos, infectados por qualquer uma das amostras de A. fumigatus, mostrou predominância de células mononucleares, em infiltrados difusos, indícios de angioinvasão e invasão brônquica com ruptura de fibras elásticas em ambas as estruturas, além de exuberância de filamentação dos conídios para ambas as amostras fúngicas, desde os tempos iniciais da infecção experimental. O processo inflamatório observado nos pulmões dos animais imunocompetentes, infectados por ambas as amostras de fungos, foi constituído nos tempos iniciais por neutrófilos e se tornou exuberante após 72 horas, com predomínio de macrófagos. Foi observada integridade de vasos sanguíneos e discreta ruptura de parede brônquica no parênquima pulmonar. Para estes animais, salienta-se a ausência de transformação dos conídios de A. fumigatus em hifas para a amostra 699, em todos os períodos de observação. A contagem total de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA) foi significativamente maior, 72 horas pós-infecção, para os animais neutropênicos e imunocompetentes, infectados por ambas as amostras do fungo. A contagem diferencial revelou a presença de macrófagos e neutrófilos, com a primeira célula sempre em maior quantidade no LBA dos animais neutropênicos em comparação com os animais imunocompetentes, independentemente do período da infecção e da amostra fúngica infectante. Ao contrário, o número de neutrófilos foi sempre mais relevante nos animais imunocompetentes. Por microscopia eletrônica de transmissão foi observado que a interação do fungo (conídios ou hifas) com as células de defesa do LBA envolveu íntima adesão e fusão entre os componentes de superfície de ambas as células. A presença de hemoglobina no LBA foi oriunda de lesão alvéolo-capilar causada pelo crescimento e invasão provocados pelas amostras fúngicas ou por lesão determinada pela própria reação inflamatória. Concluímos que os neutrófilos são essenciais na defesa contra A. fumigatus, pois na ausência dessa população celular os fungos rapidamente invadem e lesam o parênquima pulmonar. No entanto, deve-se considerar que a simples presença do fungo em animais imunocompetentes induz a migração de neutrófilos para o sítio da infecção, os quais também causam dano tecidual. As amostras de A. fumigatus com perfis distintos de produção de elastase não refletiram em diferenças significantes para a mortalidade ou gênese das lesões pulmonares observadas em camundongos neutropênicos, sugerindo que embora a elastase contribua para a ruptura das fibras elásticas observadas no tecido pulmonar, outros fatores de virulência, como a morfogênese, podem assumir um papel mais relevante para a patogênese da API experimental. / Invasive Pulmonary Aspergillosis (IPA) is an opportunistic fungal disease, caused mainly by Aspergillus fumigatus, that affects immunocompromised patients. To better understand this mycoses, we originally established in C57BL/6 mice an experimental model of neutrophils depletion by intraperitoneal inoculation of antibodies anti GR-1/Ly-6G, confirmed by total and differential leukocyte counts from blood. Next, we evaluated the evolution of experimental pulmonary infection using two strains of A. fumigatus, previously characterized as weak (strain 699) and strong (strain 1753) elastase producers. None of immunocompetent infected mice died with 7 days of observation, while neutropenic mice, infected with both strains, showed 100% mortality after 5 days, with survival curves nearly overlap, suggesting that the major contribution to the virulence was the immune status instead of elastase activity of each fungal strain. For analysis of lung parenchyma, mice were sacrificed 24, 48 and 72 hours post-infection. During the course of experimental infection it was observed a reduction of fungal burden in the lungs, for both strains of A. fumigatus, but this reduction was not statistically significant between the infected groups (neutropenic and immunocompetent). The cellular pattern of the inflammatory infiltrate observed in lungs from neutropenic mice, infected with both strains of A. fumigatus, revealed a predominance of mononuclear cells, a diffuse pattern and clear evidences of angioinvasion, bronchial disruption with break of elastic fibers in both structures, besides exuberance of conidia filamentation for both fungal strains, since the early period of experimental infection. The inflammatory process observed in lungs from immunocompetent mice, infected with both fungal strains, was composed on early times by neutrophils and became exuberant after 72 hours, with predominance of macrophages. It was observed integrity of blood vessels and moderate bronchial wall disruption in lung parenchyma. A relevant observation was the lack of transformation of conidia in hyphae for 699 A. fumigatus strain, in all periods of observation. Total leukocytes count in bronchoalveolar lavage (BAL) was significantly higher at 72 hours post-infection for both groups infected with both strains. The differential count revealed the presence of macrophages and neutrophils, with the former always in greater percentage in BAL from neutropenic mice and the latter always more elevated in immunocompetent group. Analysis by transmission electron microscopy demonstrated that the interaction of fungal structures (conidia or hyphae) with the defense cells (neutrophlis or macrophages) of BAL involved an intimate adhesion and fusion between the surface components from both cells. The presence of hemoglobin in BAL was a result of alveolar injury caused by the fungal development and invasion, but also by injuries determined by the inflammatory process itself. We concluded that neutrophils have a critical role against A. fumigatus since the pathogen quickly invades and damages the lung parenchyma in its absence. However, we must consider that the mere presence of A. fumigatus in immunocompetent mice induces the neutrophils migration to the infection site, which can also cause a tissue injury. Strains of A. fumigatus with distinct patterns of elastase production did not reflect in significant differences in mortality or origin of pulmonary lesions observed in neutropenic mice, suggesting that although elastase contributes to elastic disruptions observed in pulmonary tissue, another virulence factors, such as morphogenesis, can assume a more relevant role for pathogenesis of experimental IPA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-24042012-132231 |
| Date | 02 April 2012 |
| Creators | Raphael Luiz de Holanda e Silva |
| Contributors | Claudia Maria Leite Maffei, Roberto Martinez, Mario Leon Silva Vergara |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Patologia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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