O Sistema Nervoso Central (SNC) humano é formado por cerca de 86,1 bilhões de neurônios entre o encéfalo e a medula espinhal. O desenvolvimento pré-natal humano (tempo da concepção ao nascimento) possui cerca de 38 semanas, e é dividido na fase embrionária que corresponde ao período das 8 semanas iniciais da gestação, seguido pela fase fetal. A fase embrionária é o período mais vulnerável à ocorrência de anormalidades congênitas. Por ser um órgão com grande período de desenvolvimento, o SNC está sujeito às alterações genéticas, epigenéticas e ambientais. Durante a fase de implantação do embrião, o DNA é mais vulnerável às influências externas, como à fumaça do cigarro, aumentando o risco de retardo do desenvolvimento fetal, o risco de morte súbita pós-natal e de anormalidades do sistema imune. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos da exposição à fumaça do cigarro sobre o processo de neuroinflamação da prole de camundongos C57BL/6 expostos à fumaça do cigarro durante a gestação e desafiados ou não com LPS. Para tanto, camundongos C57BL/6 fêmeas prenhes foram expostas à fumaça do cigarro desde o plug vaginal até o nascimento da prole. No 3º dia de vida, os filhotes foram separados para três linhas de trabalho: 1) in vivo: os animais foram desafiados com LPS pelo período de 4h, seguidos de eutanasia e análises de PCR Array do SNC. 2) in vitro: os encéfalos dissecados foram utilizados para a preparação de cultura mista de glia e da cultura enriquecida com neurônio. Após a maturação celular, as células foram estimuladas com LPS 100 ng/mL e, após 24h, foram realizados ensaios de CBA, citometria de fluxo, PCR, dosagem de NO, avaliação de morte celular e metilação global. 3) Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE): após o desmame, os animais foram mantidos em suas caixas moradia por 8 semanas sem nenhum estímulo externo, e então foram imunizados com MOG35-55 para o desenvolvimento da EAE. Nos experimentos in vivo observamos o aumento da transcrição de genes relacionados ao processo inflamatório, como interleucinas e quimiocinas. Em relação aos experimentos in vitro observamos maior crescimento de células astrocitárias (astrogliose), e células da microglia com aumento de moléculas co-estimuladoras (CD80 e CD86) bem como da transcrição e concentração de citocinas pró-inflamatórias e produção de NO. Em cultura enriquecida de neurônio, foi observado aumento na porcentagem de células em apoptose no grupo exposto à fumaça do cigarro desafiados ou não com LPS. O bloqueio da atividade da microglia pela minociclina reverteu a apoptose e diminuiu a produção de NO minimizando a morte celular. Em relação aos experimentos de EAE, os animais expostos à fumaça do cigarro no período gestacional, quando imunizados na vida adulta apresentam aumento no grau da doença bem como maior persistência da mesma quando observado escore clínico, além de acompanhados de um grau maior de infiltrado celular e desmielinização. Desta forma podemos concluir que a exposição à fumaça do cigarro durante o período gestacional leva a uma programação fetal com aumento da resposta neuroinflamatória frente a um estimulo sistêmico, trazendo consequências na vida adulta. / The human central nervous system (CNS) is made up of about 86.1 billion neurons between the brain and the spinal cord. The human prenatal development (time from conception to birth) is about 38 weeks, and is divided into the embryonic phase that corresponds to the period of the initial 8 weeks of gestation, followed by the fetal phase. The embryonic stage is the period most vulnerable to the occurrence of congenital abnormalities. Because it is an organ with a long period of development, the CNS is subject to genetic, epigenetic and environmental changes. During the embryo implantation phase, DNA is more vulnerable to external influences such as cigarette smoke, increasing the risk of delay on fetal development, risk of sudden postnatal death, and abnormalities of the immune system. In this context, the aim of this work is to evaluate the effects of exposure to cigarette smoke on the neuroinflammation process of offspring of C57BL/6 mice exposed to cigarette smoke during gestation and challenged or not with LPS. For this, pregnant female C57BL/6 mice were exposed to cigarette smoke from vaginal plug to offspring birth. On the 3rd day of life the offspring were separated into three lines of work: 1) in vivo: the animals were challenged with 1mg/Kg LPS and after 4h they followed to euthanasia; PCR analysis of the CNS was made in this period. 2) in vitro: dissected encephalons were used for the preparation of mixed culture of glia and the culture enriched with neuron. After cell maturation, the cells were stimulated with 100 ng/mL LPS and, after 24 hours, CBA, flow cytometry, PCR, NO assay, cell death and global methylation assays were performed. 3) Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE): After weaning, the animals were kept in their housing for 8 weeks without any external stimulus, and then were immunized with MOG35-55 for the development of EAE. In the in vivo experiments we observed increased transcription of genes related to the inflammatory process, such as interleukins and chemokines. In vitro experiments showed higher growth of astrocytes (astrogliosis) and microglia cells with increased stimulatory molecules (CD80 and CD86) as well as the transcription and concentration of proinflammatory cytokines and NO production. In the enriched neuron culture, an increase in the percentage of cells in apoptosis was observed in the group exposed to cigarette smoke challenged or not with LPS. Blocking microglial activity by minocycline reversed apoptosis and decreased NO production by minimizing cell death. The EAE experiments shows that the animals exposed to cigarette smoke in the gestational period, when immunized in adulthood, present an increase in the degree of the disease as well as a greater persistence of the disease; The higher as the clinical score higher is the degree of cellular infiltration and demyelination. In this way we can conclude that the exposure to cigarette smoke during the gestational period leads to a fetal programming with increased neuroinflammatory response to a systemic stimulus and that this is able to last until the adult stage.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02072019-180048 |
| Date | 19 June 2019 |
| Creators | Durão, Ana Carolina Cardoso dos Santos |
| Contributors | Marcourakis, Tania, Peron, Jean Pierre Schatzmann |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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