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Previous issue date: 2016-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Bovine babesiosis and anaplasmosis are distinct diseases, which constitute the
syndrome called tick fever, characterized by infection of red blood cells. Its distribution in
herds causes the reduction in productivity and high economic losses to livestock
worldwide. Anaplasma marginale, Babesia bovis, and Babesia bigemina are the
predominant species in Brazil. Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the biological
vector of babesiosis and anaplasmosis may be transmitted by ticks, hematophagous
flies, and fomites. It is known that the water buffalo can become infected with Babesia
and Anaplasma, but little is known the extent of the infection and how it affects the
health of these animals. Thus, the present study aimed to determine the frequency and
the level of infection by B. bovis, B. bigemina and A. marginale in 108 water buffalo (50
calves and 58 adult females), naturally infested with the tick R. (B). microplus raised in
farms located in areas of endemic stability in São Paulo state. From each animal, a
blood sample from the jugular vein was taken for DNA extraction and packed cell volume
(PCV) determination. Samples from auricular vessels were taken for blood smears. The
body temperature was measured with a mercury thermometer column. Electrochemical
impedance spectroscopy technique was used to differentiate the serum of uninfected
animals from the serum of animals infected with B. bovis. To this end, antigens derived
from culture were immobilized on gold electrodes (150 nm thick) to give a biosensor
device using the compound [Fe (CN) 6] 3- / 4-proof redox. The peripheral blood smears
were stained with May-Grunwald-Giemsa for research of hemoparasites by optical
microscopy. DNA extractions were performed using the Easy DNA TM Kit (Invitrogen).
DNA amplification protocols were tested with primers specific to B. bigemina, B. bovis,
and A. marginale using nested PCR (nPCR) and quantitative real-time PCR (qPCR).
qPCR was used to estimate the number of copies of the gene cytochrome b (mt-cytB) of
both babesias and Anaplasma msp 1b gene in all samples. Merozoites of B. bigemina
were seen in blood smears of three calves from the Alambari herd (all less than 0.1 of
parasitemia). Molecular techniques, nPCR, and qPCR, were more sensitive in the
detection of parasites that direct examination of the blood smears and the frequencies of
infection were 20:37% and 100% for B. bovis and 59.26% and 100% to B. bigemina,
respectively. CN of the mt-cytB gene of B. bovis and B. bigemina showed significant
effects (p <0.05) of herd age, species, and their interaction. The CN values were higher
(p≤0.05) for B. bovis (2.81 ± 0:07) when compared to B. bigemina (2.61 ± 12:07) and A.
marginale (0:57 ± 0:07). These data suggest a high frequency of infection by B. bovis
and B. bigemina in the population of water buffalo studied. Preliminary testing of
diagnosing infection with B. bovis device showed changes in the impedance in the
system used and clearly demonstrated that the biosensor can detect infected animals,
which can be exploited for rapid detection of B. bovis infections and also extended for
the test to other parasites. / A babesiose e anaplasmose bovina são enfermidades distintas, que constituem o
complexo chamado de Tristeza Parasitária Bovina (TPB), caracterizada por infecção
das células vermelhas do sangue. Sua distribuição nos rebanhos ocasiona redução na
produtividade e grandes perdas econômicas para a pecuária mundial. Anaplasma
marginale, Babesia bovis e Babesia bigemina são as espécies prevalentes no Brasil. O
carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o vetor biológico das babesioses, e a
anaplasmose, além do carrapato pode ser transmitida por moscas hematófogas ou
fômites. Sabe-se que, os búfalos podem se infectar com os agentes da TPB, porém
pouco é conhecido a extensão dessa infecção e como ela afeta a saúde desses
animais. Assim o presente estudo teve o objetivo de determinar a frequência e o nível
de infecção por B. bovis, B. bigemina e A. marginale em 108 búfalos d’água (50
bezerros e 58 fêmeas adultas), naturalmente infestados com o carrapato R. (B).
microplus, oriundos de fazendas localizadas em áreas endêmicas para as babesioses
no estado de São Paulo. Foram colhidas amostras de sangue dos capilares auriculares
para confeccção de esfregaços em lâminas de vidro e sangue da veia caudal para
extração de DNA e determinação do volume globular (VG) pela técnica do
microhematócrito. A técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica foi
realizada com o soro dos bovinos, com o objetivo de diferenciar animais saudáveis dos
animais infectados com B. bovis. Para tanto, antígenos provenientes de cultura foram
imobilizados em eletrodos de ouro (150 nm de espessura) dando origem a um
dispositivo biossensor utilizando o composto [Fe (CN)6]3-/4-como prova redox. Os
esfregaços de sangue periférico foram corados com May Grunwald-Giemsa para a
pesquisa dos hemoparasitas por meio de microscopia óptica. As extrações de DNA
foram feitas usando o Easy-DNATM Kit (Invitrogen). Foram testados protocolos de
amplificação do DNA com primers específicos para B. bigemina, B. bovis e A. marginale
por meio de Nested PCR (nPCR) e PCR em tempo real quantitativo (qPCR), usado para
estimar o número de cópias (NC) do gene do citocromo b (mt-cytB) de ambas as
babesias e do gene de superfície 1b (msp1b) de Anaplasma em todas as amostras.
Foram visualizados merozoítas de B. bigemina nos esfregaços sanguíneos de três
bezerros do rebanho de Alambari (todos com menos de 0,1 de parasitemia). As técnicas
moleculares, nPCR e qPCR foram mais sensíveis para a detecção dos parasitas que o
exame direto das lâminas, sendo que as frequências de infecção foram de 20.37% e
100% para B. bovis e 59.26% e 100% para B. bigemina, respectivamente. O NC do
gene do mt-cytB de B. bovis e B. bigemina mostrou efeitos significativos (p<0.05) para
rebanho-idade, espécies e sua interação. Os valores de NC foram superiores (p≤0.05)
para B. bovis (2.81 ± 0.07) quando comparado a B. bigemina (2.61 ± 0.07) e A.
marginale (0.57 ± 0.07). Estes dados sugerem uma elevada frequência de infecção por
B. bovis e B. bigemina na população de búfalos estudada. Os testes preliminares do
dispositivo de diagnóstico da infecção por B. bovis mostraram alterações na impedância
do sistema usado e evidenciaram claramente que o biossensor é capaz de
diferencia/detectar os animais infectados, podendo ser explorado para a detecção
rápida da B. bovis e estendido também para a detecção de outros parasitas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/8757 |
| Date | 29 June 2016 |
| Creators | Néo, Thalita Athiê |
| Contributors | Anibal, Fernanda de Freitas, Oliveira, Márcia Cristina de Sena |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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