Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-02T13:00:39Z
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2015_DiogoMartinsdeSá.pdf: 8864026 bytes, checksum: 31e06adc819c9c1f38cd303d53cd3d41 (MD5) / O Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram positiva pertencente ao grupo Bacillus cereus, mas se distingue de outras espécies deste grupo por produzir, durante a esporulação, inclusões cristalinas contendo predominantemente uma ou mais proteínas de ação inseticida (toxinas Cry e Cyt), também chamadas de δ-endotoxinas. Por definição, toxinas Cry exibem toxicidade experimentalmente verificável a um organismo alvo, ou possuem similaridade significativa de sequencia à uma toxina Cry já descrita. A toxicidade de Cry1Ab é amplamente relatada para larvas da mariposa Manduca sexta e estudos indicam que o domínio II é responsável pelo reconhecimento específico dessa toxina ao receptor no intestino do inseto. Cry1Aa, Cry1Ab e Cry1Ac possuem 82 a 90% de identidade de resíduos de aminoácidos e a interação dessas proteínas com receptores primários do tipo caderina é descrita como um importante passo para a correta remoção da α-hélice 1 no domínio I e subsequente desencadeamento de eventos que levam à morte do inseto. Usando-se de modelagem por homologia e docking molecular, foram selecionados dois modelos descrevendo as interações entre o receptor de M. sexta, BT-R1, e a toxina Cry1Ab. Estes modelos foram submetidos à simulações por dinâmica molecular clássica e avaliados quanto a diversos aspectos de sua estrutura. Um total de 12 blocos de interação foram identificados para cada proteína e estudados quanto às suas propriedade biofísicas, cada qual constituído por uma região da sequência de aminoácidos de suas respectivas proteínas. As medidas de RMSD ao fim da dinâmica mostraram que os sítios de ligação ao receptor apresentam deformações menores que próprio receptor, indicando que a ligação à Cry1Ab estabiliza estas regiões. Mais que isso, os termos intermoleculares de energia de curta distância mostraram um declínio contínuo e uma tendência de atração entre as duas proteínas. Todas as ligações de hidrogênio e pontes salinas foram mapeadas e caracterizadas de acordo com sua persistência e distância média durante a dinâmica. Por último, foi avaliado o potencial eletrostático de cada bloco de interação, o que permitiu inferir as regiões que direcionam a ligação específica da toxina ao receptor. Para validar os modelos, foram sintetizados peptídeos correspondendo a cada bloco de interação para uma análise qualitativa utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Resultados preliminares de um dos modelos mostram que o loop 3, notório por sua função no reconhecimento ao receptor, é capaz de ligar-se a uma região nunca antes relatada dos receptores tipo caderina. Essa nova região possui um perfil de hidropaticidade similar ao do epitopo de um anticorpo específico ao loop 3 e, quando comparamos medidas entre pH 7,4 e pH 9,0 em experimentos de SPR, é possível observar uma ligação de mesma intensidade entre essas duas regiões usando-se 266 vezes menos concentração de analito em pH básico. O pH fisiológico do intestino de M. sexta é aproximadamente 9,0, o que indica que um dos modelos é capaz de reproduzir aspectos da interação in vivo. O prosseguimento deste trabalho, através de técnicas in silico e experimentos in vitro, deve indicar se ambos modelos são plausíveis de ocorrer, ou se um dos modelos é preterido. No geral, esses modelos permitiram observar o comportamento da toxina enquanto ligada ao receptor e contribuem para o entendimento de muitos dos experimentos in vitro realizados envolvendo as toxinas da família Cry1A e os receptores tipo caderina. / Cry1Ab is widely described as toxic to Manduca sexta larvae and extensive substitution of loop residues in domain II suggests that this region is responsible for specific binding to receptor. Cry1Aa, Cry1Ab, and Cry1Ac share 82 to 90% amino acid residue identity to one another and their interaction with cadherin-like receptors has been described as an important step for the correct removal of alpha-helix1 in domain I and subsequent events leading to the insect's death. After homology modeling and a selective protein docking, two models describing the interactions of Cry1Ab to the M. sexta cadherin-like receptor, BT-R1, were assessed using molecular dynamics simulations. A total of 12 binding regions were identified for each protein and their biophysical properties were further evaluated. Binding sites in the receptor were shown to have lower RMSD measures than the entire receptor, indicating that the binding of Cry1Ab stabilizes these regions. Also, Van der Waals and Coulomb short-range energy terms were measured for the receptor-toxin complex and showed an attraction tendency, with decreasing energy throughout the entire simulation. All intermolecular hydrogen bonds and salt bridges were identified and characterized according to persistence of existence and mean distances, respectively, as well as their participating residues. Lastly, electrostatic potential for each binding site was assessed, permitting to infer regions that guide specific binding of toxin to receptor. To further investigate the importance of each binding region and validate our model, we synthesized peptides corresponding to each of these regions. Result for one model show that loop 3, notorious for receptor recognition, binds a region previously unidentified in Manduca sexta cadherin-like receptor. This new toxin binding region shows the same hydropathicity profile of an antibody epitope previously described to bind specifically to loop 3. Most interestingly, binding occurs with over 266-fold less peptide concentration in pH 9.0 than in pH 7.4. The physiological pH in the insect midgut is approximately 9.0, which corroborates that at least one of the models reproduces in-vivo interaction. Ongoing work will show if both models are plausible to occur, or if one of them is preferable to the other. Overall, these models allowed the observation of the toxin's behavior when binding to BT-R1 and have helped explain many in vitro experiments concerning Cry1A and cadherin-like receptors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/19647 |
| Date | 31 March 2015 |
| Creators | Sá, Diogo Martins de |
| Contributors | Sá, Maria Fátima Grossi de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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