A Tuberculose é uma das doenças infecciosas mais antiga e bem descrita. Entretanto, ainda permanece como um dos principais problemas de saúde pública a ser enfrentado em âmbito global. A implantação de novas estratégias no controle da Tuberculose requer uma melhor compreensão dos mecanismos que sucedem a fagocitose das micobactérias por macrófagos. Após a fagocitose, as micobactérias dão início a um conjunto de ações para sobreviverem e se replicarem no ambiente intracelular, entre as quais a provável interferência no processo de morte celular. Estudos mostram que M. tuberculosis pode apresentar habilidade de interferir no mecanismo de morte celular. Essa habilidade se tornou um desafio a ser estudado devido às implicações que isso deve ter na patogênese da doença. O nosso estudo teve por objetivo analisar a expressão de genes anti-apoptóticos (bcl-2, bcl-x e mcl-1) e pro-apoptóticos (bak, bax e bid) por PCR em tempo Real em macrófagos humanos derivados de células THP-1 após diferenciação induzida por PMA. Além disso, analisar a porcentagem de fragmentação de DNA nesses macrófagos, utilizando a citometria de fluxo, pois a fragmentação internucleossômica do DNA é uma das características apresentadas por células apoptóticas. Para as infecções foram utilizados isolados clínicos de M. tuberculosis com perfil de suscetibilidade a fármacos diferentes e a cepa padrão H37Rv (ATCC). Os dados de expressão foram analisados pela diferença de entre os isolados clínicos sensíveis, resistentes a três dos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose humana e a cepa padrão H37Rv, utilizando-se o método de 2-ΔΔCT. Para comparar os resultados de expressão gênica, bem como a porcentagem de fragmentação de DNA, nos macrófagos infectados com os diferentes isolados clínicos, foram utilizados análise de variância (ANOVA) e o teste de comparação múltipla de Tukey. Os resultados sugerem, que os isolados clínicos resistentes a INH, RIF e EMB utilizados no nosso estudo, bem como a cepa padrão H37Rv (ATCC), não induzem mecanismos anti-apoptóticos para evadir da resposta imune. A ocorrência de fragmentação de DNA nos macrófagos infectados é um indicativo de morte por apoptose ou pyroptose. Além disso, o tempo de infecção éum fator importante e, com certeza, infecções com tempos maiores poderiam induzir ainda mais a morte dos macrófagos infectados. / Tuberculsis, an ancient infection disease, continues to thrive. Although well described, it remains a world health problem to overcome. The development and application of new strategies to control Tuberculosis requires a better understanding of mechanisms involved in mycobacteria-macrophages interaction. Following phagocytosis, mycobacteria initiates a variety of actions to survive and multiply themselves inside macrophages. According to researches, mycobacteria might interfere in the cell death mechanism. This ability became a challenge to be studied due to its implications in the pathogenesis of the disease. The aim of this study was to analyze the gene expression of anti-apoptotic (bcl-2, bcl-x e mcl-1) and pro-apoptotic genes (bak, bax e bid) in PMA-treated THP-1 cells by Real Time qPCR. Moreover, the percentage of macrophage DNA fragmentation was assessed by flow citometry because internucleosomal DNA fragmentation is characteristic of apoptotic and pyroptotic cell death. The infection was carried out using clinical isolates of M. tuberculosis resistent to multiple drugs, drug susceptibility and the M. tuberculosis H37Rv strain. The difference in the expression profile among clinical isolates, susceptible and resistant to three drugs used in the TB treatment, and the M. tuberculosis H37Rv were evaluated with the method 2-ΔΔCT. In order to compare gene expression patterns as well as the percentage of DNA fragmentation in macrophages infected with different clinical isolates, it was used analysis of variance (ANOVA) and Tukey`s multiple comparison test. The results suggest that M. tuberculosis H37Rv and the clinical isolates presenting higher drug resistant profile might induce programmed cell death in macrophages after 24-h infection. This was observed in the gene expression pattern and also in the macrophage DNA fragmentation profile, which indentifies apoptosis or pyroptosis. Therefore, it is suggested these clinical isolates and M. tuberculosis H37Rv do not present anti-apoptotic mechanisms to evade immune response. Moreover, the infection time is an important factor and, definitely, infections for long time could induce increase death of the infectados macrophages.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10092012-141753 |
| Date | 16 April 2012 |
| Creators | Souza, Walkiria de Araújo |
| Contributors | Hirata, Mario Hiroyuki |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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