Este trabalho apresenta estudos bioanalíticos envolvendo a bactéria Xylella fastidiosa. A X. fastidiosa é uma bactéria aeróbica, responsável pela doença Clorose Variegada dos Citros. Durante o projeto genoma foi possível mapear diversas proteínas, sendo uma das enzimas a hidroxinitrila liase (HNL). As indústrias de química fina, em especial a farmacêutica, vêm utilizando enzimas para produção de enantiômeros que visam à formação de novas drogas quirais com alto teor de pureza. As enzimas HNLs são proteínas presentes na superfamília α/β-hidrolases, da qual também fazem parte as lipases e esterases. As hidroxinitrilas são empregadas na síntese de compostos quirais, para melhores condições em biocatálise. HNLs são enzimas que catalisam a formação reversível de cianoidrinas utilizando ácido cianídrico (HCN) e aldeídos ou cetonas. Por esta razão, foi analisado o potencial de biocatálise enantiosseletiva da XfHNL referente ao substrato (R,S)-ibuprofeno e a síntese do éster racêmico, α-metil benzil acetato, e também a síntese de cianoidrinas catalisadas pela XfHNL. Pelas três reações estudadas neste trabalho foi possível observar que XfHNL não possui enantiosseletividade em dois dos substratos testados. Também foi estudado neste trabalho a expressão proteica nos meio de cultura líquidos XDM2, XDM4 e XDM5 até então não estudados por eletroforese OFFGEL, uma nova plataforma semi-preparativa para fracionamento de proteínas. Foi realizado um estudo preliminar desse meios, para avaliar a expressão proteica, e também o meio de cultura BCYE para visualizar possíveis fatores sinal difusível (DSF) por espectrometria de massas e seu comportamento em eletroforese capilar. Por fim, foi fabricado um microdispositivo de microfluídico feito em poliéster-toner (PT) para biomimetizar o xilema para o estudo in vitro de X. fastitiosa e seu comportamento na colonização. Assim sendo, foi possível visualizar o crescimento, a formação de biofilme e a presença de goma xantana dentro do microchip. / This work involves bioanalytical studies of Xylella fastidiosa. The X. fastidiosa is an aerobic bacteria, responsible for the disease Citrus Variegated Chlorosis. During the genome project was possible to characterize several proteins, one of the enzymes hydroxynitrila lyase (HNL). Industries, especially pharmaceuticals, have been using enzymes for production of enantiomers aimed at the formation of new chiral drugs with high purity. Enzymes are proteins present in HNLs superfamily α / β-hydrolases, which are also part of lipases and esterases. The HNLs have been employed in the synthesis of chiral compounds for better conditions in biocatalysis. HNLs are enzymes that catalyze the reversible formation of cyanohydrins using hydrocyanic acid (HCN) and aldehydes or ketones. For this reason, we investigated the potential of enantioselective biocatalysis of XfHNL respect to substrate (R,S)-ibuprofen and synthesis of racemic ester, α-methyl benzyl acetate. Also, the synthesis of cyanohydrins catalyzed by XfHNL. By three reactions involved in this work, it was observed that there were not XfHNL enantioselectivity in 2 of the substrates studied. Also, it was studied protein expression in liquid culture medium XDM2, XDM4 and XDM5 hitherto studied by electrophoresis OFFGEL, a new platform for semi-preparative protein fractionation. We conducted a quick study and through this liquid medium, BCYE, to view possible DSFs by mass spectrometry and their behavior in capillary electrophoresis. And finally, it was produced a PT microdevice in order to mimic the xylem vessels to study of X. fastitiosa in vivo and its behavior. Accordingly, it is possible to display the growth, biofilm formation and the presence of xanthan gum in the microchip.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03122013-161330 |
| Date | 27 September 2013 |
| Creators | Souza, Fayene Zeferino Ribeiro de |
| Contributors | Carrilho, Emanuel |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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