Il core catalitico della DNA polimerasi III, composto dalle tre subunità α, ε e θ, è il complesso minimo responsabile della replicazione del DNA cromosomiale in Escherichia coli. Nell'oloenzima, α ed ε possiedono rispettivamente un'attività 5'-3' polimerasica ed un'attività 3'-5' esonucleasica, mentre θ non ha funzioni enzimatiche. Il presente studio si è concentrato sulle regioni del core che interagiscono direttamente con ε, ovvero θ (interagente all'estremità N-terminale di ε) e il dominio PHP di α (interagente all'estremità C-terminale di ε), delle quali non è stato sinora identificato il ruolo. Al fine di assegnare loro una funzione sono state seguite tre linee di ricerca parallele. Innanzitutto il ruolo di θ è stato studiato utilizzando approcci ex-vivo ed in vivo. I risultati presentati in questo studio mostrano che θ incrementa significativamente la stabilità della subunità ε, intrinsecamente labile. Durante gli esperimenti condotti è stata anche identificata una nuova forma dimerica di ε. Per quanto la funzione del dimero non sia definita, si è dimostrato che esso è attivamente dissociato da θ, che potrebbe quindi fungere da suo regolatore. Inoltre, è stato ritrovato e caratterizzato il primo fenotipo di θ associato alla crescita. Per quanto concerne il dominio PHP, si è dimostrato che esso possiede un'attività pirofosfatasica utilizzando un nuovo saggio, progettato per seguire le cinetiche di reazione catalizzate da enzimi rilascianti fosfato o pirofosfato. L'idrolisi del pirofosfato catalizzata dal PHP è stata dimostrata in grado di sostenere l'attività polimerasica di α in vitro, il che suggerisce il suo possibile ruolo in vivo durante la replicazione del DNA. Infine, è stata messa a punto una nuova procedura per la coespressione e purificazione del complesso α-ε-θ / The DNA polymerase III catalytic core, containing the three subunits α, ε, and θ, is the minimal active polymerase complex responsible of chromosomal DNA replication in Escherichia coli. In the holoenzyme, α displays 5’-3’ polymerase activity and ε features 3’-5’ exonuclease activity, while θ has no enzymatic function. The present study was focused on the core regions directly interacting with ε, i.e. θ (interacting with ε N-terminal domain), and the PHP domain of α (interacting with ε C-terminal domain), for none of which a role has been identified yet. To assign them a function three research lines were engaged. First, the role of θ was investigated using ex-vivo and in vivo approaches. The results presented here show that θ significantly increases the stability of the intrinsically labile ε subunit. During these experiments a new dimeric form of ε was identified. While the dimer function is not clear, it is shown to be actively dissociated by θ, which could then act as its regulator. Furthermore, the first growth phenotype associated to θ is provided. As regard to α PHP domain, a pyrophosphatase activity was determined using a new assay, realized to monitor the kinetics of reactions catalyzed by phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. PHP-catalyzed pyrophosphate hydrolysis was also shown to be able to sustain α-driven in vitro DNA polymerization, suggesting its possible role in vivo. Finally, a new procedure for α-ε-θ co-expression and purification is presented.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:unibo.it/oai:amsdottorato.cib.unibo.it:4639 |
| Date | 27 April 2012 |
| Creators | Conte, Emanuele <1984> |
| Contributors | Hochkoeppler, Alejandro |
| Publisher | Alma Mater Studiorum - Università di Bologna |
| Source Sets | Università di Bologna |
| Language | Italian |
| Detected Language | Italian |
| Type | Doctoral Thesis, PeerReviewed |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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