Problématiques : 1) Mes travaux de maitrise ont démontré qu’il était possible de fusionner des hormones peptidiques avec la protéine fluorescente verte (EGFP) pour obtenir des ligands de haute affinité avec un haut poids moléculaire supportant des expériences d’imagerie. Cela a permis de détecter les deux récepteurs de la bradykinine (BK; B1R et B2R) ainsi que le récepteur PTH1 de la parathormone (PTH, PTH1R), trois récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Malgré la haute affinité de ces sondes, les applications restent limitées à des systèmes surexprimant le récepteur cible recombinant. Cela s’explique par les deux raisons suivantes : a) la faible abondance des récepteurs endogènes et b) le faible rendement de la fluorescence. 2) La génération de ligands de haut poids moléculaire et la démonstration que ceux-ci avaient toujours une activité pharmacologique pourrait permettre de résoudre une problématique majeure reliée à l’administration thérapeutique de BK. Malgré l’accumulation de preuves du rôle protecteur de la BK sur le système vasculaire, les récepteurs de la BK sont des cibles pharmacologiques quasi inexploitées, car les effets délétères causés par les agonistes de la BK, notamment au niveau de l’inflammation et de la génération de douleur, semblent limiter leur développement. Objectifs : 1) Étudier la pharmacologie de la maximakinine (MK), un analogue de la BK, et le potentiel de ce peptide comme module conférant l’affinité au récepteur B2 dans la conception de ligands biotechnologiques. 2) Générer des protéines de fusion ligands des deux principales familles de GPCRs (A : B2R; B : PTH1R). 3) Utiliser ces protéines de fusion pour permettre la détection de faibles niveaux de récepteurs difficilement détectables par les stratégies conventionnelles. 4) Évaluer l’activité pharmacologique de ces protéines de fusion. Résultats : Deux des trois protéines de fusion PTH générées (PTH-myc et PTHHRP) sont capables de détecter de manière spécifique les niveaux endogènes de PTH1R exprimés par les cellules HOS (ostéosarcome humain) grâce à leur domaine peroxydase intrinsèque ou assemblé. La protéine de fusion PTH-HRP est la plus prometteuse, et peut aussi être utilisée comme ligand non-isotopique dans un essai de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du PTH1R humain. La MK est un agoniste direct du récepteur B2 de rat, mais n’a qu’une affinité marginale pour le récepteur B2 humain. L’essai de contractilité de la veine ombilicale humaine a démontré que la MK était une pro-drogue pour le B2R humain, activée par des peptidases présentes dans ce tissu. La MK ne stimule pas la dégranulation des mastocytes via le récepteur MRGPRX2, malgré sa forte charge positive. Chez le rat, la MK est un agoniste persistant, résistant à la dégradation et de haute affinité pour le B2R. La protéine de fusion fluorescente EGFP-MK est un agoniste spécifique du B2R de rat, mais pas du B2R humain. Des études in vitro ont démontré qu’elle était aussi un agoniste persistant de haute affinité pour le B2R de rat. La protéine de fusion avec domaine peroxydase APEX2-(NG)15-MK permet la détection du récepteur B2 de rat recombinant de manière spécifique et efficace. De plus cette protéine de fusion peut être utilisée comme ligand non-isotopique dans des essais de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du B2R de rat. Il est possible de générer des protéines de fusion contenant la MK agoniste du B2R de rat de très haut poids moléculaire (>66 kDa), mais ceux-ci peuvent avoir une activité pharmacologique limitée par l’encombrement stérique entre la protéine de fusion et le récepteur. Conclusions et perspectives : Il est possible de générer des protéines de fusion avec des domaines enzymatiques agonistes des récepteurs B2 et PTH1. Cela permet une amplification significative du signal émis par les iv protéines de fusion comparativement aux protéines de fusion fluorescentes. La détection des niveaux endogènes de GPCRs par des protéines de fusion pourrait permettre de les utiliser dans des tests diagnostiques. Ces travaux, qui ont démontré qu’il était possible de générer des ligands biotechnologiques de haut poids moléculaire agonistes des principales classes de GPCRs (A et B), pourraient être appliqués aux autres ligands membres de ces familles en accord avec les modèles de liaisons de chaque ligand.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/29486 |
| Date | 25 April 2018 |
| Creators | Charest-Morin, Xavier |
| Contributors | Marceau, François |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xiv, 180 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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