Partie I L’analyse de données de relaxation des spins à l’aide de l’approche model-free
est très répandue pour obtenir des informations sur la dynamique des protéines aux échelles
de temps ps-ns et μs-ms. Afin d’extraire des informations de qualité, les données sont
enregistrées à plusieurs champs magnétiques. Combiner de telles données est cependant
sujet aux erreurs expérimentales. Ainsi, la consistence des données de relaxation à plusieurs
champs doit être vérifiée. Malheureusement, cela s’effectue rarement, i.e. on assume
simplement que les données sont correctes. Nous proposons donc une approche simple pour
la vérification de la consistence de données de relaxation enregistrées à plusieurs champs.
L’utilisation des test proposés améliore l’analyse et réduit la présence artéfactuelle
d’échange conformationnel. Ainsi, comme les données d’échange conformationnel sont
souvent discutées en terme de liaison de substrat ou de catalyse, s’assurer de leur validité
améliore la compréhension biologique du système étudié.
Partie II Les b-lactamases de classe A sont impliquées dans la résistance aux
antibiotiques. Elles y participent en hydrolysant les b-lactamines. Ces enzymes ont été
étudiées par différentes approches : études mutationnelles, simulations de dynamique
moléculaire, cristallographie des rayons X et RMN. L’enzyme modèle de cette classe,
TEM-1, a précédemment été étudiée par RMN dans notre laboratoire. TEM-1 est très rigide
sur l’échelle de temps des ps-ns, mais subit des mouvements lents μs-ms au niveau du site
actif. Afin de mieux caractériser la dynamique des b-lactamases de classe A, l’homologue
PSE-4 a aussi été étudié par RMN avec des données de relaxation des spins, de dispersion
de relaxation par CPMG et d’échange d’amides. Les mêmes conclusions que pour TEM-1
ont été obtenues : rigidité générale élevée et présence de mouvements lents près du site actif.
Ces mouvements pourraient être conservés chez les b-lactamases de classe A et ainsi avoir
un lien avec la catalyse enzymatique. Cette hypothèse est renforcée par les données RMN
pour cTEM-17m, une chimère TEM-1/PSE-4, pour laquelle plusieurs résonances près du
site actif sont non observées dû à un élargissement causé par ces mouvements lents. / Part I The analysis of spin relaxation data using the model-free formalism is a widely
used approach to get insights into protein dynamics on the ps-ns and μs-ms timescales. In
order to extract high quality data, multiple magnetic field datasets are required. Combining
datasets recorded using different NMR magnets is prone to experimental errors. Hence, the
consistency of multiple field spin relaxation data must be carefully verified. Analysis of
multiple field spin relaxation data generally proceeds without verification of consistency,
i.e. with only the assumption that data is fine. We propose a simple approach to verify the
consistency of multiple field relaxation data. Using the proposed tests improves the
analytical approach by reducing the presence of artifactual conformational exchange terms.
Since these terms are often rationalised in relation with ligand binding or catalysis,
improving their confidence yields a better understanding in terms of biology.
Part II Class A b-lactamases are involved in antibiotics resistance. They do so by
hydrolysing the b-lactam antibiotics. These enzymes have been widely studied by different
approaches including mutational studies, MD simulations, X-ray crystallography and NMR.
The model enzyme for this class of proteins, TEM-1, has previously been studied by NMR
in the laboratory. It was observed that TEM-1 is a highly ordered protein on the ps-ns
timescale, with slower μs-ms motions clustered around the active site. In order to
characterize further the backbone dynamics of class A b-lactamases, the homologous
enzyme PSE-4 was studied by NMR using different approaches such as spin relaxation,
CPMG relaxation dispersion, and amide exchange experiments. The same conclusions as
for TEM-1 were obtained with a high rigidity along the sequence balanced by slower
motions in the vicinity of the active site. These motions might be conserved in class A
b-lactamases and potentially be important for catalysis. This hypothesis is further enforced
by the backbone resonance assignments for cTEM-17m, a TEM-1/PSE-4 chimera, where
many resonances are unobservable around the active site, potentially suffering from line
broadening caused by slow motions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QQLA.2010/27269 |
| Date | 05 1900 |
| Creators | Morin, Sébastien |
| Contributors | Gagné, Stéphane |
| Publisher | Université Laval |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Rights | © Sébastien Morin, 2010 |
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