El análisis del metaboloma presenta multitud de aplicaciones en el estudio de los sistemas biológicos debido a la disponibilidad actual de técnicas analíticas. En la presente memoria, se ha desarrollado una plataforma de perfil metabólico que incluye: la paralización del metabolismo celular (quenching), la extracción de los metabolitos intracelulares, el análisis cualitativo/cuantitativo de los metabolitos y el procesamiento de datos. Debido a que diversos metabolitos son extremadamente lábiles, se validó el protocolo de extracción de los mismos. Los resultados mostraron que el NADP(H), NAD(H),glutatión (GSH y GSSG), y la relación de AcetilCoA/CoA, se alteraban al incluir la liofilización en el proceso o el metanol/agua como disolvente de extracción. En consecuencia, el protocolo basado en ACN/CHCl3 resultó ser el más eficiente y se aplicó en el estudio de diversos sistemas biológicos (Capítulos 2-5). En el Capítulo 2, se aplicó el análisis metabólico para el estudio de los mecanismos de resistencia a la quimioterapia. Se determinaron 21 metabolitos por LC-UV en las líneas celulares: L1210 (sensible a daunomicina, DNM), L1210R (resistente a múltiples fármacos) y CBMC-6 (expresa la glicoproteína P, P-gp), antes y después de la exposición a DNM. L1210R y CBMC-6 presentaron 5 y 2 veces, respectivamente, la concentración de GSH con respecto a L1210, lo cual se correlacionó con la alta supervivencia de estas células durante la exposición a DNM. Además, las relaciones NADH/NAD+, AcCoA/CoA, la carga energética (AEC), entre otros, resultaron mayores en L1210R que en L1210. Curiosamente, las células CBMC-6 presentaron un comportamiento intermedio entre las otras dos, posiblemente debido a la presencia de la P-gp. En el capítulo 3, se analizó el metaboloma de hígados de ratas con la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), donde se cuantificaron por LC-MS más de 70 metabolitos. Los resultados mostraron diferentes perfiles metabólicos entre los hígados sanos y con EHGNA, en concordancia con los los biomarcadores clásicos. La alteración metabólica incluyó las moléculas redox (GSH, GSSG, NAD(P)(H)), y otros metabolitos como L-carnitina, CoA y diversos aminoácidos. En el Capítulo 4, se estudiaron los eventos metabólicos que tuvieron lugar en E. coli durante la exposición a altas concentraciones de NaCl durante un tiempo prolongado. Las alteraciones metabólicas intracelulares incluyeron aminoácidos, nucleótidos, metabolitos redox, L-carnitina, fosfato y derivados de CoA. Además, tuvo lugar un descenso muy pronunciado de las concentraciones de los aminoácidos extracelulares en el momento del choque osmótico. Los datos metabólicos se integraron con datos del análisis del transcriptoma por medio del análisis de rutas metabólicas (pathway-based analysis). Entre las vías alteradas se encontraron rutas del metabolismo central así como del GSH, aminoácidos y purinas. Además, se realizó el análisis de flujos metabólicos, mostrando una orientación hacia la síntesis de productos de fermentación, tales como etanol en el caso de NaCl 0.5M y lactato en el caso de NaCl 0.8M. En el Capítulo 5, se estudió la función de la deacetilasa de E. coli (CobB) en quimiostatos con acetato como única fuente de carbono. Se realizó el análisis del metaboloma y transcriptoma, y ambos conjuntos de datos se integraron por medio del análisis de rutas metabólicas. Los resultados obtenidos mostraron que los efectos más notables tuvieron lugar en el metabolismo del azufre y del nitrógeno, sugiriendo que el metabolismo del nitrógeno podría estar directa o indirectamente regulado por la acetilación de proteínas. En conclusión, la metabolómica ha sido utilizada con éxito en la presente Memoria en conjunción con la transcriptómica, la flujómica o biomarcadores clásicos. Asimismo, la cuantificación de cofactores redox, nucleótidos, coenzimas y aminoácidos es sumamente importante para la comprensión global del estado metabólico, siendo clave ATP, GSH, AcCoA, CoA y algunos aminoacidos ya que al menos uno de los mencionados ha resultado alterado en todas las situaciones descritas en esta Tesis a lo largo de los Capítulos 2-5. Además, algunas de las moléculas clave mencionadas como GSH, AcCoA, CoA y también NAD(P)H han resultado ser lábiles durante el proceso de extracción, de modo que es esencial el uso de un protocolo que no altere per se estos metabolitos. / Metabolome analysis is widely used in the study of biological systems due to the affordable analytical techniques currently available. A metabolic profile platform has been carefully developed, including quenching of the cell metabolism, extraction of the intracellular metabolites, qualitative/quantitative analysis and data processing. The metabolic quantification process has been thoroughly validated, including some commonly used steps such as lyophilization, since our results suggested that the ratios NADPH/NADP+, NADH/NAD+, GSH/GSSG and the AcetylCoA/CoA were modified when lyophilization was included in the extraction process or when methanol/water is used as the extraction solvent. To avoid this, a highly efficient extraction protocol based on ACN/CHCl3 was validated with standard mixtures. Then, the metabolome analysis was applied to the study of metabolic alterations in liver tissues or bacterial cultures. In Chapter 2, it is shown how metabolic analysis contributed to the better understanding of the chemotherapy resistance mechanisms. For that purpose, 21 metabolites were determined by LC/UV before and after DNM exposure in different murine cell line cultures: L1210 (sensitive to DNM), L1210R (multidrug-resistance phenotype, MDR) and CBMC-6 (L1210 transfected with the glycoprotein P, P-gp). P-gp is one of the known mechanisms of chemotherapy resistance since it is able to take out the drug outside the cell. The results showed that L1210R and CBMC-6 presented 5 and 2-fold, respectively, the concentrat on of GSH with respect to L1210, which suggest that this metabolite plays a protective role since it was correlated with the high survival percentage of these lines during DNM exposure. Additionally, the NADH/NAD+, AcCoA/CoA, adenylate (AEC), uricilate (UEC) and guanylate (GEC) energy charge ratios were always higher in L1210R than in L1210. Interestingly, CBMC-6 cells presented an intermediate behaviour between the other two due to the presence of the P-gp. In Chapter 3, the metabolome analysis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rat livers was carried out with more than 70 metabolites being identified and quantified by LC/MS. The metabolic pattern showed clear differences between healthy and NALFD-livers attending to the diet and as assessed by classical biomarkers. Interestingly, the metabolic alteration included not only redox molecules (GSH, GSSG, NAD(P)(H)), as expected, but also other metabolites such as L-carnitine, CoA and amino acids. In Chapter 4, the long-term exposure of E. coli to osmotic stress has been studied from a metabolic point of view, where it was seen that intracellular metabolic levels were highly dependent on the NaCl concentration in the medium. The results obtained pointed to clear alterations in several metabolites, such as intracellular amino acids, nucleotides, redox coenzymes, acetyl phosphate and CoA derivatives. Moreover, the depletion of extracellular amino acids was measured when NaCl was added. These metabolic data were combined with the transcriptomic profile using integration pathway-based analysis, highlighting the main pathways affected, namely, GSH metabolism, glycolysis/gluconeogenesis, amino acid biosynthesis/degradation, purine metabolism, phosphorylative oxidation, and the TCA cycle/glyoxylate shunt. In addition, metabolic flux analysis pointed out a fermentation pattern that depended on the NaCl concentration. In Chapter 5, metabolome analysis was carried out to shed light on the role of the only known deacetylase of E.coli (CobB) in acetate-feeding chemostats. Moreover, transcriptomic analysis was performed and both data sets were integrated by using pathway-based analysis. The results showed the main effects were in both the sulfur and nitrogen pathways, including CoA, taurine, pyrimidines and several amino acid metabolisms, suggested that nitrogen metabolism is directly or indirectly regulated by protein acetylation. To conclude, metabolome analysis can be used in conjuction with other techniques such as transcriptomics, fluxomics or classical experiments. The quantification of redox cofactors, nucleotides, coenzymes and amino acids is highly important for the understanding of the whole metabolic state in biological systems being key metabolites GSH, ATP, AcCoA, CoA and some amino acids since at least one of them has resulted altered in any of the situations described along Chapters 2 to 5. Surprisingly, GSH, AcCoA, CoA and also NAD(P)H concentrations could be altered during the extraction process therefore the use of an appropriate extraction protocol has been proved to be essential.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UM/oai:www.tdx.cat:10803/363198 |
| Date | 19 January 2016 |
| Creators | Bernal Martínez, Cristina |
| Contributors | Cánovas Díaz, Manuel, Iborra Pastor, José Luis, Sevilla Camins, Ángel, Universidad de Murcia. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular B e Inmunología |
| Publisher | Universidad de Murcia |
| Source Sets | Universidad de Murcia |
| Language | Spanish |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 216 p., application/pdf |
| Source | TDR (Tesis Doctorales en Red) |
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