Introduction: One of the many sources of low back pain (LBP) is the degeneration of intervertebral discs (IVDs), a condition called degenerative disc disease (DDD). Degeneration of IVDs can occur as result of aging, trauma, or genetic predisposition. Better insight into the complex histological profile in healthy and degenerated IVDs will contribute to our understanding of the interplay between the degenerative processes and chronic pain. The knowledge gained will ultimately allow for the development of better diagnostic and therapeutic strategies towards the management of LBP. Standard hematoxylin–eosin (H&E) staining, alone or in combination with other methods, has been traditionally used to assess the normal biology and degeneration of IVDs. A novel technique has recently been developed that provides additional information than previous methods; specifically, a clear differentiation between various sub-regions of the disc. In this method, termed FAST staining, the samples are exposed to a combination of dyes, starting with Alcian blue that blocks the acidic glycoproteins of the tissue. This is followed by a Safranin-O staining through which all the rest of the neutral proteoglycans will be stained. Finally Tartrazine and Fast green are used in order to stain the remaining mucin and collagen moieties. FAST and H&E provide complementary information regarding the compartmental organization and matrix composition of the discs in different conditions of health and degeneration.The principal objective of the current study is to characterize the histological profile of healthy and degenerated human IVDs with a combination of H&E and FAST staining. We will also present some preliminary data regarding the study of innervation in these samples using fluorescent immunohistochemistry (IHC). This will allow future investigations on the relationship between pain and the innervation pattern. Methods: Tissue samples: Samples of degenerating IVDs were collected from chronic low back pain patients. Healthy control discs were obtained post-mortem from donors. Histology: FAST and H&E were performed on cryostat sections obtained from fixed, frozen disc samples. Assessment of innervation: The analysis of the innervation and vascularization in different parts of the discs was done through immunohistochemical mapping studies using specific markers for nerve fibers (anti-PGP 9.5 and anti- CGRP) and blood vessels (anti-PECAM 1). Results: FAST staining enables differentiation of the three regions of the disc: inner annulus fibrosus, outer annulus and nucleous pulposus. In addition, a promising protocol for IHC was adapted to this type of tissue.Conclusion: FAST staining provides detailed information about disorganization of extracellular matrix, proteoglycan changes and calcification during the process of degeneration. H&E and FAST are complementary as one gives more information about the cellular content while the other better identifies the disc compartments, respectively. In addition, sparse sensory innervation can be observed in the very outer regions of healthy human IVDs using immunohistochemical methods. / Introduction : La dégénérescence des disques intervertébraux (DIVs) est une des sources connues de lombalgie. Cette condition, reconnue sous le nom de discopathie dégénérative, peut être conséquente du vieillissement, d'un traumatisme ou de prédispositions génétiques. Un meilleur aperçu du profil histologique de DIVs sains et dégénérés contribuera à approfondir notre compréhension des effets du processus dégénératif sur la douleur chronique. De plus, l'avancée des connaissances contribuera au développement de meilleurs diagnostics ainsi qu'à de meilleures stratégies thérapeutiques lors de la prise en charge de patients souffrant de lombalgie. La méthode standard de coloration tissulaire à base d'hématoxyline-éosine (H&E), utilisée seule ou en combinaison avec d'autres colorants, est couramment employée pour évaluer la biologie des DIVs sains ou dégénérés. Récemment, une nouvelle méthode a été développée afin de fournir de l'information additionnelle comme la différentiation définie entre les diverses sous-régions du disque. En utilisant la coloration FAST, les échantillons sont exposés à une combinaison d'agents colorants. Dans un premier temps, le bleu alcien bloque les glycoprotéines acides du tissu. Les protéoglycanes neutres restants sont ensuite colorés par la solution de Safranine-O. Finalement, les colorants Tartrazine et Fast green sont utilisés afin de colorer les fragments moléculaires de mucines et de collagènes. Les colorations FAST et H&E procurent de l'information complémentaire en ce qui concerne la composition de la matrice ainsi que l'organisation structurale des disques et ce, en présence ou non de dégénérescence tissulaire. L'objectif primaire de l'étude est de caractériser les profils histologiques de DIVs humains, sains ou dégénérés, à l'aide des colorations FAST et H&E. De plus, des données préliminaires d'une étude complémentaire sur l'innervation de ces mêmes échantillons observée par immunohistochimie (IHC) sont présentées à la toute fin. Ces données ouvrent la porte pour de futures recherches afin de comprendre la relation entre le patron d'innervation des DIVs et la douleur. Méthodes : Échantillons : Des échantillons tissulaires de DIVs dégénérés ont été recueillis chez des patients ayant de la douleur chronique lombaire. Des disques sains contrôles ont été obtenus de donneurs post-mortem. Histologie : Des coupes de tissus congelés et fixés ont été obtenues à l'aide d'un cryostat, puis colorées à l'aide des méthodes FAST et H&E. Évaluation de l'innervation : L'analyse de l'innervation et de la vascularisation des diverses régions des disques s'est effectuée par une étude de localisation immunohistochimique utilisant des marqueurs spécifiques pour les fibres nerveuses (anti-PGP 9.5 et anti-CGRP) et les vaisseaux sanguins (anti-PECAM 1). Résultats : La coloration FAST permet la différentiation des trois régions principales du disque : l'anneau fibreux interne, l'anneau fibreux externe et le noyau pulpeux. Un protocole d'IHC efficace a été adapté spécifiquement pour ce tissu. Conclusion : La coloration FAST fournit de l'information détaillée sur la désorganisation de la matrice extracellulaire, les changements au niveau des protéoglycanes ainsi que sur la calcification discale survenant lors du processus de dégénérescence. Les colorations H&E et FAST sont complémentaires puisque, de façon respective, une donne de l'information sur le contenu cellulaire alors que l'autre identifie clairement les sous-régions composant le disque. À l'aide de méthodes d'immunohistochimie, il est possible d'identifier une innervation sensorielle dispersée dans les régions les plus externes de disques humains sains.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107835 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Tabatabaei Shafiei, Zahra Sadat |
| Contributors | Laura Stone (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Faculty of Dentistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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