Most mitochondrial mRNAs in trypanosomatid parasites require uridine insertion/deletion RNA editing, a process mediated by guide RNA (gRNA) and catalyzed by multi-protein complexes called editosomes. The research presented in this thesis began at a time when many of the proteins in the editosome complexes and some of their functions and interactions had been identified. However, little was known about how these proteins assemble and work together. Recent studies have established that the six oligonucleotide/ oligosaccharide binding (OB)-fold proteins (KREPA1-A6), are a part of the common core of editosomes where they form a network of interactions essential for the stability of the editosomes and some of them also bind the substrate RNA. This thesis explores the RNA and protein interactions of an OB-fold protein KREPA4 to gain better understanding of its role in the structural and functional organization of editosomes. KREPA4 is an RNA binding protein essential for the integrity of editosome complex and survival of Trypanosoma brucei. Recombinant KREPA4 binds to gRNA with a preference for the gRNA 3ʹ oligo(U) tail. The only other protein, with which KREPA4 is currently known to have a direct interaction, is another OB-fold protein, KREPA6. KREPA4 has two predicted low compositional complexity regions (LCRs) at its N-terminus, besides the predicted OB-fold domain at the C-terminal end. Different parts of one or both of these regions may be involved in the RNA and protein interactions of KREPA4 within the editosome complex, and these possibilities have been investigated in this thesis. In the first part of the thesis, I examined the gRNA binding properties of KREPA4. To map the RNA-binding domain, I created deletion mutants of KREPA4, and evaluated their gRNA-binding affinities as well as specificities by gel shift RNA binding and competition experiments. My results demonstrate that the predicted C-terminal OB-fold of KREPA4 is responsible for high-affinity binding of this protein to gRNA via interaction with the gRNA oligo(U) tail. I also show that the stem-loop structure of gRNA contributes to the affinity and specificity of KREPA4-RNA interaction by binding to the N-terminal LCRs of KREPA4. Furthermore, I tested KREPA4 for the presence of a possible RNA annealing activity and found the annealing function to be associated with the predicted OB-fold, representing the first report of such activity for a core component of the RNA editing complex. The second part of this thesis is devoted to a study characterizing the protein interaction interfaces of KREPA4 in the editosome complex. By screening a series of N- and C-terminally truncated KREPA4 fragments, I determined that a predicted α-helix of KREPA4 OB-fold is required for its interaction with KREPA6. An antibody against the KREPA4 α-helix or mutations of this region can eliminate association with KREPA6; while a peptide fragment corresponding to the α-helix can independently interact with KREPA6, thereby supporting the identification of KREPA4-KREPA6 interface. I also established that the predicted OB-fold of KREPA4; independent of its interaction with gRNA, is responsible for the stable integration of KREPA4 in the editosomes, and editing complexes co-purified with the tagged OB-fold can catalyze RNA editing. Therefore, while KREPA4 interacts with KREPA6 through the α-helix region of its OB-fold, the entire OB-fold is required for its integration in the functional editosome, possibly through additional protein-protein interactions. Overall, these studies have lead to the identification and characterization of RNA binding and protein interaction interfaces of KREPA4, and also revealed the RNA annealing function of this protein. Therefore, this work provides new insight into the possible molecular interactions of KREPA4 within the editosome, thus contributing significantly to the emerging picture of the structural and functional organization of the editosome complex. / La plupart des ARN messager mitochondriaux dans les parasites de la famille des trypanosomatides nécessite l'édition de l'ARN par insertion ou délétion de l'uridine, un processus médié par l'ARN guide (ARNg) et catalyser par des complexes multi protéiques appelés éditosomes. De récentes études ont montré que les six protéines de liaison oligonucleotide/oligosaccharide (KREPA1-A6), font partie du même groupe d'éditosome où ils forment un réseau d'interactions essentiels pour la stabilité des éditosomes. Certains de ces éditosomes s'associent aussi à l'ARN. Cette thèse explore l'interaction ARN-protéine de la protéine de liaison OB, KREPA4, pour obtenir une meilleure compréhension de son rôle dans l'organisation structurelle et fonctionnelle des éditosomes. KREPA4 est une protéine de liaison à l'ARN, essentielle pour l'intégrité du complexe d'éditosome et pour la survie du parasite Trypanosoma brucei. La protéine recombinante KREPA4 se lie à l'ARNg avec une préférence pour la queue oligo (U) à l'extrémité 3' de l'ARNg. La seule autre protéine présentement connu comme ayant une interaction directe avec KREPA4, est une autre protéine de liaison OB, KREPA6. KREPA4 possède à son extrémité N-terminale, deux régions de basse complexité (LCRs) prédites en plus du domaine de liaison OB à son extrémité C-terminale. Différentes parties d'une ou de deux de ces régions pourraient être impliqué dans les interactions de KREPA4 à l'ARN et à la protéine au sein du complexe d'éditosome. Dans la première partie de cette thèse, Je présente une étude examinant les propriétés de liaison à l'ARNg de la protéine KREPA4. Afin de cartographier le domaine de liaison à l'ARN, nous avons créé des mutants de délétion de la protéine KREPA4 et évalué leur affinité de liaison à l'ARNg ainsi que leur spécificité par des expériences de compétitions ou de retard sur gel. Nos résultats ont montrés que le domaine prédit à l'extrémité C-terminale OB de la protéine KREPA4 est responsable de la forte affinité de liaison de cette protéine à l'ARNg via l'interaction avec la queue oligo (U) de l'ARNg. Nous avons aussi montré que la structure en tige-boucle de l'ARNg contribue à l'affinité et à la spécificité de l'interaction entre KREPA4 et l'ARN par la liaison aux LCRs de l'extrémité N-terminale de KREPA4. De plus, nous avons testé KREPA4 pour la présence d'une possible activité d'annelation et nous avons trouvé la fonction d'annelation qui est associe avec le domaine prédit OB, ce qui représente le premier rapport d'une telle activité pour un composant essentiel du complexe d'édition de l'ARN. La deuxième partie de cette thèse est consacrée à une étude caractérisant des interfaces d'interactions protéiques de KREPA4 dans le complexe d'éditosome. Nous avons déterminé qu'une α-hélice prédite du domaine prédit OB de KREPA4 est nécessaire pour son interaction avec KREPA6. Un anticorps ciblant l'α-hélice de KREPA4 ou les mutations de cette région peut éliminer son association avec KREPA6, alors qu'un fragment peptidique correspondant à l'α-hélice peut interagir indépendamment avec KREPA6, supportant ainsi l'identification de l'interface KREPA4-KREPA6. Nous avons également établi que le domaine OB prédit de KREPA4, indépendant de son interaction avec ARNg, est responsable de l'intégration stable de KREPA4 dans les éditosomes. Par conséquent, si KREPA4 interagit avec KREPA6 dans la région α-hélice de son domaine OB, l'ensemble du domaine OB est nécessaire pour son intégration dans un éditosome fonctionnelle, possiblement par le biais d'interactions protéine-protéine additionnelles. Dans l'ensemble, ces études ont conduit à l'identification et la caractérisation de la liaison des ARNs et des interfaces d'interactions protéiques de KREPA4, et a également révélé la fonction d'annelation d'ARN de cette protéine. Par conséquent, ce travail offre une nouvelle perspective sur les interactions moléculaires possibles de KREPA4 dans l'éditosome.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114349 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Kala, Smriti |
| Contributors | Reza Salavati (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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