Cryptosporidium parvum and Trypanosoma brucei are two protozoan parasites that can cause life-threatening illnesses in humans. Over 70 million people on the African continent are at risk of contracting T.brucei. In the case of C.parvum, infections are cosmopolitan, and a major problem is that it can be acquired very easily and requires only an infectious dose of 10 oocysts to cause the illness. If released in the public water supplies, C.parvum can endanger entire cities. This is one reason why C.parvum is categorized as a Class B bioterrorist weapon. Despite the threat C.parvum poses and the severe illness T.brucei causes, current treatments against these parasites are insufficient. These treatments fail to consistently eliminate the parasites and cause many adverse side effects. Furthermore, no significant improvements to the efficacy of these currently available treatments have been made. Given the need to find new drugs against these parasites and improve treatments, we tested the anti-parasitic activity of two compounds against T.brucei and C.parvum, respectively. First, we looked at the in vivo activity of TH-III-149, a cyclopropyl-indol, against T. brucei and then the in vitro and in vivo activity of oleyl-PC, a phosphocholine analog, against C. parvum. To begin, we looked at the effects of TH-III-149 against T.brucei by using a CD1 mouse model of infection. We demonstrated that an 8mg/kg treatment of TH-III-149 for three days resulted in a significant decrease in parasite replication rates compared to non-treated mice. By real-time PCR quantification of blood parasitemia, we showed that non-treated, T.brucei-infected mice had a thousand-fold increase in parasite burden between day 2 and 4 of infection. In comparison, only a 7.5-fold increase in parasite burden was observed in mice treated with TH-III-149. Results from blood smears and microscopy also confirmed this reduction in the replication rate of parasites. The treatment of infected mice with TH-III-149 delayed the patent period (appearance of parasites in the blood smear) by two days when compared to non-treated mice. In non-treated mice, parasite in the blood smears appeared at day 4 of the infection, while TH-III-149-treated mice only exhibited parasites in the blood smears at day 6. In addition, this compound showed minimal signs of toxicity, as non-infected mice treated with 8mg/kg of TH-III-149 for three days did not exhibit weight loss, hepatomegaly or splenomegaly. Therefore, our results support the development of TH-III-149 as a new treatment against T.brucei. In parallel, we also tested oleyl-PC against C.parvum. We showed that in vitro oleyl-PC has an IC50 of 22.9nM against C.parvum. Toxicity was evaluated using human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8 cells) and was not significant at concentrations below 100µM (TC50=153.7 µM). The ratio between the TC50 and the IC50 allowed us to calculate a therapeutic index of 6.7x103. The in vivo animal study confirmed the activity of oleyl-PC previously seen in vitro. Treating C57BL/6 IFNγR-KO mice with 40mg/kg of oleyl-PC for ten days resulted in the cure (clearance of blood parasitemia) in 75% of the mice and a percent survival of 100% after 30 days (P < 0.001). In contrast, all of the non-treated mice succumbed to C. parvum infection and died by day 11. Using real-time PCR, oleyl-PC-treated mice showed no detectable levels of parasitic DNA in their intestines 30 days post infection, which indicates that these mice successfully cleared their parasitic infections. These results were confirmed by histological analysis of sections of the ileum which were clear of C.parvum oocysts. Furthermore, after ten days of treatment with 40mg/kg of oleyl-PC, no signs of toxicity were seen in treated mice; non-infected oleyl-PC-treated mice were monitored for visible behavioral changes and weight loss. Therefore, our results support the development of oleyl-PC as a new safe and effective treatment against C.parvum. / Cryptosporidium parvum et Trypanosoma brucei sont deux parasites protozoaires qui peuvent causer des maladies mortelles chez les humains. Confinées au continent africain, les infections dues à T.brucei affectent plus de 70 millions d'habitants. Dans le cas de C.parvum, les infections qui sont cosmopolites causent un problème majeur puisque la dose infectieuse n'est que de 10 oocysts. De plus, ce parasite peut être obtenu facilement et peut mettre en danger plusieurs villes, s'il est relâché dans les eaux potables. C'est un des raisons pourquoi ce parasite a été catégorisé comme une arme bio-terroriste de classe B. Malgré les risques majeurs associés à C.parvum et la maladie sévère de T.brucei, aucun progrès n'a été fait pour améliorer les traitements actuels. Ceux-ci n'ont toujours pas réussi à démontrer leur efficacité en plus de causer des effets secondaires sérieux. Vu le besoin urgent de trouver de meilleurs traitements, nous avons testé l'activité de TH-III-149, un indole-cyclopropane, contre T.brucei dans une étude in vivo ainsi que le oleyl-PC, un analogue de la phosphocholine, contre C.parvum dans des études in vitro et in vivo. Pour commencer, nous avons observé les effets du TH-III-149 contre T.brucei dans un modèle de souris CD1. Les résultats in vivo ont démontré qu'un traitement de trois jours en utilisant 8 mg/kg cause une réduction significative dans le taux de réplication du parasite en comparaison aux souris non-traitées. En utilisant le PCR en temps réel comme méthode de quantification, nous avons démontré que la charge en parasite dans le sang des souris non-traitées a augmenté de mille fois entre les jours 2 et 4, tandis qu'elle n'a augmenté que de 7.5 fois dans les souris qui ont été traitées. Les résultats des frottis sanguins ont confirmé cette réduction dans le taux de réplication des parasites. En effet, l'apparition de parasites dans les frottis sanguins a été observée dès le jour 4 de l'infection dans les souris non-traitées, tandis qu'elle n'a pu être observée qu'à partir du jour 6 dans les souris traitées avec le TH-III-149. De plus, ce composé n'a pas révélé de signes de toxicité car les groupes de souris non-infectées traitées pendant trois jours avec 8 mg/kg n'ont pas démontré de splénomégalie, d'hépatomégalie ni de perte de poids. Donc, nos résultats supportent le développement de TH-III-149 en tant que nouveau traitement contre les infections de T.brucei. En parallèle, nous avons aussi testé l'oleyl-PC contre C.parvum. Nos résultats in vitro démontrent que la concentration nécessaire pour réduire de 50% le taux de réplication du parasite (IC50) est de 25nM. La toxicité a été évaluée en utilisant une culture entérique humaine en couche monocellulaire (HCT-8). Les résultats de celle-ci démontrent que les premiers signes de toxicité apparaissent à partir de 100µM (TC50=123µM). Le ratio entre le TC50 et le IC50 a permis de calculer un index thérapeutique de 5x103. Les résultats in vivo ont servis à confirmer l'activité in vitro de oleyl-PC. En effet, le traitement de dix jours des souris C57BL/6 IFNγR-KO avec 40mg/kg de oleyl-PC a réussi à guérir (absence de parasitémie sanguine) 75% des souris, tout en gardant un taux de survie de 100% après le jour 30 (P<0.001). En contraste, toutes les souris non-traitées ont succombées à l'infection à la fin du jour 11. En utilisant le PCR en temps réel, aucune trace d'ADN provenant de C.parvum n'a pu être détectée dans les intestins de ces souris 30 jours après l'infection. Ces résultats ont été confirmés par l'analyse des lamelles histologique de l'ilium de ces souris où l'absence d'oocyst de C.parvum a été observée. De plus, chez les souris non-infectées, un traitement de dix jours avec 40 mg/kg de oleyl-PC n'a pas causé d'effets secondaires visibles tels qu'une perte de poids. Donc, nos résultats supportent le développement de l'oleyl-PC en tant que nouveau traitement sécuritaire et efficace contre les infections de C.parvum.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.116979 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Renteria Flores, Axel |
| Contributors | Armando Jardim (Internal/Cosupervisor2), Momar Ndao (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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