The obligate intracellular pathogen Toxoplasma gondii is one of the most successful pathogens in the world, with an average worldwide infection rate of ~30 % in humans. The ability of the T. gondii to establish persistent infections in immunocompetent hosts is likely due to its immune evasion strategies that include interference with T cell activation, blocking of pro-inflammatory cytokine signaling while stimulating anti-inflammatory signaling and preventing the expression of major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules by immune cells. This blocking the production of MHC-II by professional antigen presenting cells dampens the CD4+ T cell response and delays the onset of cellular immunity, thereby allowing T. gondii to establish a lifelong chronic infection. Infection of professional antigen presenting cells with live parasites and exposure to parasite lysate both result in a blockage of IFN-gamma dependant MHC-II production and surface expression. However, the mechanisms of inhibition by live parasites differ from those observed with parasite lysates suggesting multiple and non-redundant mechanisms of MHC-II expression inhibition during a T. gondii infection. The active molecules from parasite lysates likely represent proteins secreted by the parasite that act on host cells even prior to their infection. The parasite molecule(s) responsible for this important immune evasion mechanism remain(s) unknown. In our studies, we used sub-cellular fractionation and chromatographic techniques to isolate and enrich for the protein(s) responsible for interfering with IFN-gamma dependant MHC-II production. Preliminary experiments demonstrated that the active component was a soluble protein. Sub-cellular fractionation experiments indicated that inhibition levels corresponded to the amount of dense granules, a specialized T. gondii secretory organelle, present in the fractions. We also demonstrated that extracellular parasites actively secrete proteins and that these excretory-secretory antigens (ESA) contain MHC-II expression inhibiting molecule(s). Size-exclusion chromatography of soluble parasite lysate and ESA indicated MHC-II expression inhibiting molecules were present in fractions representing a large size range of proteins. Most of these molecules were however confined to the fractions containing the largest proteins and/or protein complexes. To isolate the active molecules, a two-step fractionation process was devised. ESA proteins were first subjected to anion-exchange chromatography and the fraction presenting the greatest abundance of MHC-II expression inhibition was then further separated by size-exclusion chromatography for isolation and enrichment of active molecule(s). The latter separated the active molecule(s) into two fractions. LC-MS/MS analysis of these fractions identified 24 candidate Toxoplasma gondii proteins responsible for the inhibition of MHC-II expression in bone marrow derived macrophages. / Le parasite protozoaire intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii est l'un des pathogènes les plus prolifiques, avec une incidence mondiale d'environ 30 % chez les humains. La capacité de T. gondii d'établir une infection persistante dans un hôte immunocompétent est accomplie grâce à son éventail de stratégies qui lui permet d'échapper au système immunitaire de l'hôte, incluant l'interférence de l'activation des cellules T, la dérégulation du signalement des cytokines pro-inflammatoires, la promotion du signalement des cytokines anti-inflammatoires et l'inhibition de l'expression des molécules complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) par les cellules immunitaires. En bloquant l'expression de CMH-II par les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles, la réponse des cellules T CD4+ est réduite et le déclanchement de l'immunité cellulaire est retardé, permettant à T. gondii d'établir une infection chronique qui persiste pour le reste de la vie de l'hôte. Une infection par des parasites vivants ou l'exposition à des lysats de parasites bloquent tous deux la synthèse de molécules de CMH-II induite par l'IFN-gamma et leur expression à la surface cellulaire par les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles. Cependant, les mécanismes d'inhibition par des parasites vivants diffèrent de ceux observés avec les lysats de parasites, ce qui suggère qu'une multitude de mécanismes non-redondants soient sollicités pour inhiber l'expression de CMH-II lors d'une infection par T. gondii. Les molécules actives présentes dans les lysats de parasites sont probablement des protéines normalement sécrétées par le parasite qui agissent sur les cellules hôtes précédant l'invasion. Les molécules du parasite responsables de ce mécanisme important d'évasion du système immunitaire restent inconnues à ce jour. Pour nos recherches, nous utilisâmes un fractionnement subcellulaire et des techniques de chromatographie pour isoler et enrichir les protéines responsables de l'activité inhibitrice sur l'expression de CMH-II. Des résultats préliminaires démontrèrent que la composante active provient de protéines solubles. De plus, des fractionnements subcellulaires révélèrent que l'activité inhibitrice se retrouvait dans les fractions enrichies d'organelles sécrétoires, nommément les rhoptries (ROP) et les granules denses (GRA). Nous démontrâmes aussi que les parasites extracellulaires sécrètent activement des protéines et que ces antigènes excrétés-sécrétés (ESA) contiennent des molécules qui inhibent l'expression de CMH-II. Une séparation par chromatographie d'exclusion stérique de la fraction soluble des lysats de parasites et des ESA révéla que les molécules inhibitrices de CMH-II se retrouvaient dans des fractions de protéines de tailles variées. Toutefois, la plupart des ces molécules étaient confinées aux fractions contenant des protéines de larges tailles et/ou des complexes protéiques. Pour isoler davantage les molécules inhibitrices, un fractionnement à deux étapes fut élaboré. Les protéines provenant d'ESA furent séparées par chromatographie d'échange d'anions et la fraction obtenue qui affichait la plus grande activité inhibitrice fut séparée davantage par chromatographie d'exclusion stérique pour isoler et enrichir les molécules d'intérêt. Nous obtînmes deux fractions suivant cette méthodologie et les analysâmes par LC-MS/MS, ce qui généra une liste de 24 protéines de Toxoplasma gondii potentiellement responsables de l'inhibition de l'expression de CMH-II par des macrophages dérivés de la moelle osseuse.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.117163 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Dasanayake, Dayal |
| Contributors | Armando Jardim (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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