The trypanosomatid parasite Leishmania infects 12 million people in tropical countries. This neglected tropical disease causes debilitating and often fatal consequences in the absence of chemotherapeutic intervention. Consequently, there is a need to identify new drug targets to combat the increasing incidence of resistance to current treatments. An attractive drug target in these parasites is the glycosome, a unique microbody organelle that compartmentalizes several essential enzymatic pathways behind an impermeable membrane. The Leishmania major Peroxin 7 (LPEX7) is a receptor protein that recognizes glycosomal matrix proteins containing an N-terminal peroxisomal targeting signal 2 (PTS2) and facilitates the trafficking of these proteins across the glycosomal membrane. Genetic studies in the related trypanosomatid parasite, Trypanosoma brucei, have demonstrated that PEX7 is essential for parasite viability. LPEX7 is predicted to have a hydrophobic outer surface which has made production of this recombinant protein in the E. coli heterologous system challenging. LPEX7 was successfully purified in the presence of non-ionic detergents, however, this limited the usefulness of this protein in regards to downstream in vitro studies with glycosomal membranes. To investigate the biophysical role of LPEX7 in the trafficking and import of proteins into the glycosome, we have developed a strategy to reliably express and purify recombinant Leishmania PEX7 in the absence of detergents. Subsequent biochemical studies confirmed that the recombinant LPEX7 was functionally active and, like the native protein or detergent purified protein, binds LdPEX5 and PTS2 cargo proteins with nanomolar affinities. Initial investigations of the quaternary structure demonstrated that LPEX7 is in equilibrium between a dimer and tetramer in solution. Preliminary protein-protein interaction domain mapping studies have demonstrated that the C-terminal half LPEX7 was sufficient to bind both LdPEX14 and LdPEX5. / Le parasite trypanosomatide Leishmania affecte plus de 12 millions d'individus dans les pays tropicaux. Cette maladie tropicale négligée a de graves conséquences, parfois fatales, en absence d'interventions thérapeutiques. Il y a, par conséquent, urgence d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre ce fléau et restreindre l'incidence de résistance envers les médicaments présentement employés. Une cible thérapeutique de choix s'est révélée récemment dans cette famille de parasite. Il s'agit du glycosome, un organelle qui compartimente plusieurs voies métaboliques derrière une membrane imperméable. La Péroxine 7 de Leishmania major (LPEX7) est un récepteur cytosolique qui reconnaît certaines protéines destinées pour le glycosome contenant un signal peptidique de type 2 (PTS-2) à leur terminal N et qui facilite le transport vers la membrane du glycosome. Récemment, des études génétiques sur le parasite trypanosomatide Trypanosoma brucei ont démontré que PEX7 est essentiel pour la survie du parasite. Des prédictions bio-informatiques révèlent que LPEX7 contient une surface extérieure hydrophobe, ce qui explique le défi que représente la production de cette protéine de façon recombinante dans le système E. coli. LPEX7 fut purifiée avec succès en présence de détergents ioniques, ce qui a toutefois limité les possibilités d'études d'interactions avec des membranes. Dans le but d'étudier le rôle biophysique de LPEX7 dans le transport et l'importation de protéines vers le glycosome, nous avons développé une stratégie pour exprimer et purifier LPEX7 de façon recombinante en l'absence de détergents. Ensuite, nos études biochimiques ont confirmé que LPEX7 recombinante est active et, tout comme LPEX7 précédemment purifiée avec l'aide de détergents, est capable de lier les protéines contenant un signal PTS-2 et LdPEX5 à des concentrations nano-molaires. Une investigation de la structure quaternaire de LPEX7 a révélé que le récepteur s'assemble en dimères et tétramères en solution. Finalement, des études préliminaires d'interaction protéine-protéine ont illustré que LPEX7 contient un site d'attachement pour LdPEX5 et LdPEX14 sur la demie portion terminale C.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110401 |
| Date | January 2012 |
| Creators | McLean, James |
| Contributors | Armando Jardim (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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