Flatworms of the genus Schistosoma are wide-spread and clinically significant parasites of humans in the tropics and sub-tropics. In evolutionary terms, they are representatives of the earliest metazoans to have evolved separate sexes, and to possess anatomically distinct central and peripheral nervous systems. Schistosome infections are currently controlled by a single drug, praziquantel (PZQ), but the emergence of schistosome strains resistant to PZQ is a growing concern.A deeper understanding of the basic biology of schistosomes is the first step towards target-based drug discovery. Neuronal receptors of schistosomes are attractive targets for drug development because all major physiological activities and behaviors in these parasites are coordinated by their nervous system. Neuronal signaling in schistosomes is mediated by a variety of neurotransmitters and associated receptors, including members of the pentameric ligand-gated ion channel (pLGIC) superfamily. The S. mansoni genome encodes 4 putative non-AChR-like inhibitory pLGIC subunits and 13 putative nAChR-like pLGIC subunits.The work presented in this thesis focuses on L-glutamate (L-glu) neuronal signaling in S. mansoni. L-glu is an important neurotransmitter in essentially all vertebrate and invertebrate phyla, but its functional roles in S. mansoni are poorly understood. Here, we further contribute to knowledge in this field by providing the first molecular evidence for the contribution of an inhibitory, glutamate-gated Cl channel (GluCl)-mediated component to glutamatergic neurotransmission in S. mansoni.First, we show that the 4 non-AChR-like inhibitory pLGIC subunit candidates encode GluCl subunits (SmGluCl-1-4) that are pharmacologically and evolutionarily distinct from insect, nematode and snail GluCls. Using an electrophysiology approach in Xenopus oocytes, we demonstrate that SmGluCl-1, -2 and -3 subunits exhibited low micromolar affinity for L-glu, are permeable to Cl , but are insensitive to ivermectin and meclonazepam. Phylogenetic analyses suggest that the SmGluCl subunits belong to a previously uncharacterized clade of flatworm GluCls that includes several GluCl candidates from related trematode and cestode species.Then, we provide evidence that the SmGluCl subunits are expressed in all human stages of the parasite. An analysis of SmGluCl stage-specific expression by RT-PCR amplification reveals that transcripts from all 4 SmGluCl subunits are expressed in S. mansoni cercaria, schistosomules, adults and eggs. Confocal immunolocalization reveals that all the SmGluCl subunits are widely expressed in the nervous system of male and female worms, and exhibit partially overlapping expression patterns in the central nervous system and in the peripheral nerve cords and plexuses supplying the body, attachment organs, reproductive tract and tubercles. The lack of apparent co-localization between SmGluCl subunits and phalloidin suggests that they are not expressed in the musculature. Together, these findings offer possible clues regarding the physiological functions they mediate, including interneuronal signaling, indirect regulation of motility, attachment and feeding, oogenesis and sensory signaling.Finally, we present initial data from prospective work aimed at developing a YFP assay for HTS of compound libraries against S. mansoni GluCls heterologously expressed in mammalian cells. We confirm by confocal immunofluorescence that heterologously expressed FLAG-tagged SmGluCl-2 is localized at the membrane surface of HEK-293. Further work is underway to demonstrate the feasibility of this assay for HTS against S. mansoni GluCls as a means of exploring the potential of new compounds as either therapeutic leads or pharmacological probes targeting S. mansoni GluCls to explore their physiological functions. / Les vers plats (platyhelminthes) du genre Schistosoma sont des parasites de l'homme répandus dans plusieurs régions tropicales et sous-tropicales. Le seul médicament disponible pour traiter la schistosomiase est le praziquantel (PZQ). L'émergence de souches de schistosomes résistantes au PZQ est une préoccupation croissante. Le système nerveux des schistosome exerce un contrôle exclusif sur toutes les activités physiologiques de ces parasites, déterminant leurs particularités comportementales au sein de leur hôte. La signalisation neuronale chez les schistosomes est modulée par une variété de neurotransmetteurs et des récepteurs qui leur sont associés, incluant les membres de la superfamille des récepteurs ionotropes sensible à un ligand de type pentamérique (pLGIC). Le génome de S. mansoni encode 4 sous-unités putatives de pLGIC insensibles à l'acétylcholine (non-AChR) et 13 sous-unités putatives de pLGIC de type nAChR.Le L-glu est un neurotransmetteur important, retrouvé chez presque tous les vertébrés et les invertébrés, mais les fonctions neurologiques qu'il module chez S. mansoni sont mal comprises. Cette thèse fournit la toute première preuve que le L-glu peut générer des potentiels postsynaptiques inhibiteurs médiés par l'activation de pLGICs sensibles au L-glu (GluCl). Les 4 gènes candidats encodant des sous-unités pLGIC de type non-AChR sont des sous-unités GluCl (SmGluCl-1-4). Ces récepteurs SmGluCl diffèrent des récepteurs GluCl retrouvés chez les insectes, les nématodes et les gastropodes. Des expériences d'électrophysiologie montrent que les sous-unités SmGluCl-1, -2 et -3 forment des récepteurs perméables aux ions Cl et sensibles à des concentrations de L-glu de l'ordre du micromolaire (7-27 µM), mais sont insensibles à l'ivermectine et au meclonazepam. Les analyses phylogénétiques suggèrent que les sous-unités SmGluCl appartiennent à un nouveau groupe de sous-unités GluCl retrouvées exclusivement chez les vers plats parasitaires.Ensuite, nous démontrons par RT-PCR que les ARN messagers encodantque les sous-unités SmGluCl sont produites par tous les stades de développement du parasite interagissant avec l'humain. Des expériences d'immunolocalisation révèlent que ces sous-unités SmGluCl sont abondamment exprimées dans les vers mâles et femelles, au niveau du système nerveux central, ainsi que dans certains des cordons et plexus nerveux du système nerveux périphérique innervant l'enveloppe corporelle, les organes d'attachement, l'appareil reproducteur et les tubercules. Les récepteurs SmGluCl ne sont pas exprimés dans la musculature des schistosomes. En somme, la distribution des sous-unités SmGluCl dans le système nerveux suggère que ces récepteurs pourraient être impliqués dans la signalisation interneuronale et sensorielle et pourrait réguler de manière indirecte la mobilité, l'attachement et l'alimentation et l'ovogenèse.Enfin, nous présentons des données préliminaires obtenues dans le cadre d'un projet visant à développer une méthode analytique permettant le criblage à haut débit (high-throughput screening, HTS) de banques de composés d'intérêt pharmaceutique, afin de tester leur effet sur l'activité des récepteurs GluCl des schistosomes. Cette méthode analytique sera effectuée dans des cellules de mammifères exprimant les récepteurs SmGluCl de manière hétérologue et permettra de mesurer l'activité de ces récepteurs en fonction de la fluorescence émise par la protéine YFP. Nous avons confirmé par immunolocalisation que SmGluCl-2 exprimée de manière hétérologue dans des cellules HEK-293 est localisée au niveau de la surface membranaire. D'autres travaux sont en cours pour démontrer la faisabilité de ce test pour l'identification par HTS de molécules modulant l'activité des récepteurs GluCl de S. mansoni. Les composés identifié pourront être utilisés comme sondes pharmacologiques afin d'approfondir l'étude des fonctions physiologiques modulées par les récepteurs GluCl de S. mansoni.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123127 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Dufour, Vanessa |
| Contributors | Timothy Geary (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
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