Parasites of the genus Leishmania cause a broad array of diseases, collectively termed leishmaniasis. These diseases range in morbidity; the cutaneous form is typically self healing, while the mucocutaneous and visceral manifestations require chemotherapeutic intervention to avoid lethality. At present there is no vaccine, and current methods of chemotherapeutic intervention have severe drawbacks, together creating a dire need for new options to combat these destructive diseases. An organelle within the parasite, the glycosome, has been identified as an attractive drug target. The glycosome compartmentalizes several enzymes from important biosynthetic and metabolic pathways, which has been shown to be necessary for the viability of the parasite. Although the organelle is structurally and evolutionarily related to peroxisomes of higher eukaryotes, the import machinery of the organelles differs significantly. The majority of proteins entering the glycosome contain a C-terminal PTS1 tri-peptide sequence, which is readily recognized and bound by the soluble cytosolic receptor LPEX5. The receptor binds PTS1 cargo in the cytosol, shuttling it to the glycosomal membrane where the protein interacts with LPEX14, a peripherally membrane bound protein. The interaction with LPEX14 at the glycosomal membrane, facilitated by several other biogenesis proteins, initiates the formation of a transient import pore. In this thesis research project the role of Leishmania donovani PEX5 (LdPEX5) in formation of this crucial import pore was analyzed. Using biophysical techniques, it was found that interaction of the receptor with a PTS1 did not cause major changes in secondary structure, although did provoke a conformational change in the protein, preceding and possibly facilitating its interactions with LdPEX14 at a glycosomal membrane. Using large unilamellar vesicles mimicking the glycosomal lipid composition, the domain of LdPEX5 necessary to interact with LdPEX14 was then narrowed to 268-302. Furthermore, using serial carbonate-urea extractions, the domain identified to be necessary for interaction with LdPEX14 at a glycosomal mimetic was also found to insert into the liposomal membrane, implying that the insertion of LdPEX14 into the glycosomal membrane could be drawing LdPEX5 into the membrane as part of pore formation. In conclusion, this study has implicated LdPEX5 in having a central role in formation of the transient glycosomal import pore. / Les parasites du genre Leishmania provoquent un large éventail de maladies, appelées collectivement leishmanioses. Ces maladies varient en termes de morbidité ; la forme cutanée se conclut généralement par une auto-guérison, alors que les manifestations cutanéo-muqueuses et viscérales nécessitent une intervention chimiothérapeutique pour éviter le décès. À l'heure actuelle, il n'existe aucun vaccin, et les méthodes actuelles d'intervention chimiothérapeutique présentent de graves conséquences. Il existe aujourd'hui un besoin urgent de trouver de nouvelles options pour lutter contre ces maladies destructrices. Un organite dans le parasite, le glycosome, a été identifié comme une cible thérapeutique intéressante. Le glycosome compartimente plusieurs enzymes de biosynthèses et voies métaboliques importantes; il a été prouvé que cet organite est nécessaire pour assurer la viabilité du parasite. Bien que l'organite soit structurellement et évolutivement lié aux peroxysomes des eucaryotes supérieurs, le mécanisme d'importation des organites diffère sensiblement. La majorité des protéines entrant dans le glycosome contient une séquence tri-peptide PTS1 C-terminal, qui est facilement reconnue et liée par le récepteur cytosolique soluble LPEX5. Le récepteur se lie au cargo PTS1 dans le cytosol, le conduisant vers la membrane glycosomale où la protéine interagit avec LPEX14, une protéine liée à la membrane périphérique. L'interaction avec LPEX14 au niveau de la membrane glycosomale, facilitée par plusieurs autres protéines de biogenèse, initie la formation d'un pore d'importation transitoire. Dans ce projet de thèse, le rôle de PEX5 dans la formation de ce pore d'importations essentiel a été analysé chez Leishmania donovani. En utilisant des techniques biophysiques, il a été constaté que l'interaction du récepteur avec un PTS1 n'a pas causé de changements majeurs dans la structure secondaire, bien qu'elle ait provoqué un changement de conformation de la protéine, précédant et éventuellement facilitant ses interactions avec LdPEX14 à une membrane glycosomale. Grâce à l'utilisation de grandes vésicules unilamellaires mimant la composition lipidique glycosomale, le domaine de LdPEX5 nécessaire pour interagir avec LdPEX14 fut ramené à 268-302. En outre, en utilisant des extractions carbonate-urée en série, il a été prouvé que le domaine identifié comme étant nécessaire pour l'interaction avec LdPEX14 au mimétique glycosomal, s'insère dans la membrane liposomale. De ce fait, l'insertion de LdPEX14 dans la membrane glycosomale pourrait tirer LdPEX5 dans la membrane dans le contexte de la formation de pores. En conclusion, cette étude a démontré que LdPEX5 possède un rôle central dans la formation du pore d'importation glycosomale transitoire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123260 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Davidsen, Amanda |
| Contributors | Armando Jardim (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
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