The obligate intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is a highly ubiquitous pathogen that infects virtually any warm-blooded animal. Although the infection generally remains asymptomatic in healthy individuals, the parasite invariably encysts. It has been shown that T. gondii is able to achieve this goal at least by interfering with MHC-II antigen presentation to dampen the development of the CD4+ T helper cell response and gain a head start on the host adaptive immune system. Previous reports have shown that T. gondii inhibits transcription of MHC-II and several other related genes, but the causative inhibitory molecules have yet to be identified.In an attempt to identify these molecules, a forward genetic screening strategy was initially elaborated, with a genome-wide insertional mutagenesis carried out in order to disrupt the genes encoding for the inhibitory molecules followed. By specifically isolating mutants unable to inhibit MHC-II expression and antigen presentation by flow cytometry, isolation of the disrupted loci and database mining could have enabled the identification by of the encoded inhibitory molecules. However, the screen was not carried out due to experimental limitations.Biochemical analyses were employed to further characterize the MHC-II inhibitory activity, revealing that this activity segregated with the high-speed supernatant (HSS) prepared from sonicated parasites and was enriched with increasing centrifugal speeds. The inhibitory activity was protein dose-dependent and was completely abrogated when the HSS was treated with a broad-spectrum protease. Subcellular fractionation revealed that the inhibitory activity was found in fractions enriched with secretory organelles, specifically rhoptries (ROP) and/or dense granules (GRA). Furthermore, excreted-secreted antigens (ESA) from freshly egressed tachyzoites displayed inhibitory activity. Proteins from ESA preparations were separated by a two-step fractionation using ion exchange chromatography followed size-exclusion chromatography, and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). Database mining of the MS/MS results generated a list of possible candidates, the majority of which originated from secretory organelles.Although MHC-II expression was inhibited, low levels of MHC-II molecules were still detected in infected or lysate-treated cells. Experimental results argued that the first layer of transcriptional regulation has to be complemented by a post-translational layer of interference in the host cell endocytic pathway, involving the MHC-II associated invariant chain (Ii), and peptide editor H2-DM. Ii mRNA and protein levels were induced in T. gondii-infected cells, while MHC-II and H2-DM IFN-induced expression was down-regulated. Ii accumulated in infected cells from 20 hour post-infection until host cell lysis, mainly in the ER. In Ii KO cells, the absence of Ii restored the ability of infected bone marrow-derived dendritic cells to present a parasite antigen in the context of MHC-II, arguing that Ii acts as a dominant negative on MHC-II-restricted antigen presentation of endogenously acquired parasite antigens. Keys host proteases, namely legumain, and cathepsins L and S, and the acidification of endosomal compartments were modulated by the parasite, pointing toward a wider manipulation of the host endocytic pathway by T. gondii. Opposing expression patterns of Ii and H2-DM had a drastic effect in vivo not only on parasite dissemination towards lymphoid organs, CD4+ T cell activation, and IFNγ production during acute infection, but also on cyst numbers and survival at the chronic phase of the infection. Altogether, these findings reveal a broader manipulation of host cell processes by T. gondii, and shed new light on the intricate interactions between intracellular pathogens and host cells, and their ability to subvert immune functions to establish successful infections. / Le parasite protozoaire intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii, l'agent causant la toxoplasmose, est un pathogène ubiquitaire capable d'infecter tout animal à sang chaud. En dépit du fait que l'infection reste généralement asymptomatique chez les individus en bonne santé, le parasite s'enkyste inévitablement. Il a été démontré que T. gondii est capable d'atteindre ce but en partie en interférant avec la présentation d'antigène par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH)-II pour diminuer le développement de la réponse des cellules T CD4+ et pour ainsi devancer la réponse adaptative du système immunitaire. Il a été démontré que T. gondii inhibe la transcription de CMH-II et autres gènes liés, mais les molécules inhibitrices causatives restent inconnues.Pour identifier ces molécules, une stratégie pour un criblage génétique avait été élaborée. Une mutagénèse insertionelle à travers le génome devait être conduite pour perturber les gènes codant pour ces molécules inhibitrices, suivie d'un tri par cytométrie en flux de cellules infectées avec des mutants. En isolant les mutants incapables d'inhiber l'expression de CMH-II, l'isolement des locus génétiques et l'exploration des bases de données auraient pu permettre l'identification des molécules codées. Cependant, ce criblage ne fut complété dû à des limitations expérimentales. Des analyses biochimiques ont démontré que l'activité inhibitrice se retrouvait dans le surnageant d'haute-vitesse (HSS) préparé à partir de parasites soniqués, et était enrichie avec des vitesses de centrifugation croissantes. L'activité inhibitrice était dose-dépendante de protéines et était complètement abrogée lorsque le SHV était préalablement traité avec une protéase. Un fractionnement subcellulaire révéla que l'activité se retrouvait dans les fractions enrichies d'organelles sécrétoires (rhoptries et granules denses). Aussi, des antigènes excrétés-sécrétés (ESA) obtenus de tachyzoïtes fraîchement lysés possédaient une activité inhibitrice. Les protéines d'ESA furent séparées par fractionnement en deux étapes, commençant par une chromatographie par échange d'ions, suivi par une chromatographie d'exclusion par taille et analysées par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Les résultats obtenus furent comparés aux bases de données, et une liste fut dressée avec de candidats potentiels, la majorité d'entre eux provenant d'organelles de sécrétion.Malgré l'expression réduite, quelques molécules de CMH-II étaient détectés dans les cellules infectées ou traitées. Nos résultats démontrent que la régulation transcriptionelle doit être complémentée par une interférence au niveau post-traductionel dans la voie endocytique de la cellule hôte qui implique la chaîne invariante associée au CMH-II (Ii) et l'éditeur de peptide H2-DM. Les niveaux d'ARNm et de protéines d'Ii étaient induits dans les cellules infectées, alors que ceux de CMH-II et d'H2-DM étaient inhibés. Ii s'accumulait dans les cellules infectées dès 20 heures post-infection, principalement dans le RE. Dans les cellules Ii KO, l'absence d'Ii rétablit la capacité de cellules dendritiques à présenter un antigène du parasite dans le contexte de CMH-II, proposant ainsi qu'Ii agit comme un dominant négatif sur la présentation d'antigènes endogènes provenant du parasite. Des protéases de l'hôte (légumaine, cathepsines L et S) et l'acidification des compartiments endosomaux étaient modulées par le parasite, révélant une manipulation plus étendue de la voie endocytique. Les modes d'expression opposés d'Ii et H2-DM avaient un effet in vivo sur la dissémination des parasites vers des organes lymphoïdes, l'activation des cellules T CD4+, la production d'IFN, le nombre de kystes et la survie. Collectivement, nos résultats montrent l'étendue des processus de manipulation par T. gondii, révélant de complexes interactions avec l'hôte et sa capacité de subvertir les fonctions immunitaires pour établir une infection chronique.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114251 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Leroux, Louis-Philippe |
| Contributors | Armando Jardim (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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