Ces travaux portent sur la production de caroténoïdes aromatiques par des bactéries non photosynthétiques. Les trois bactéries retenues pour cette étude sont Brevibacterium linens, Streptomyces mediolani et Mycobacterium aurum. Ces bactéries sont connues pour produire les mêmes caroténoïdes aromatiques à savoir l'isoréniératène et ses dérivés hydroxylés. La voie de biosynthèse de ces pigments est décrite jusqu'au stade isoréniératène, l'étape ultérieure permettant la formation de caroténoïdes hydroxylés constitue le sujet de cette étude.<br />Dans un premier temps, les pigments produits par ces bactéries sont étudiés par HPLC et LCMS. Ces études ont montré que B. linens et S. mediolani synthétisent majoritairement du 3,3'-di-hydroxy-isoréniératène. Elles ont également révélé l'absence de ce composé chez M. aurum. Contrairement à ce qui est décrit dans la littérature cette bactérie accumule un caroténoïde de masse moléculaire supérieure à celle du di-hydroxy-isoréniératène. Une purification a été entreprise pour une analyse en RMN mais les faibles quantités obtenues n'ont pas permis la détermination de la structure. <br />Dans un second temps, la réaction d'hydroxylation, dernière étape dans la biosynthèse de ces caroténoïdes a été étudiée. On cherche à identifier le type d'enzyme et le substrat de cette étape. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de cytochrome P450 dans les cultures bactériennes se traduit par l'accumulation d'isoréniératène et la disparition des formes hydroxylées chez B. linens et S. mediolani. Ces résultats montrent l'implication d'un cytochrome P450 dans l'hydroxylation de l'isoréniératène pour ces bactéries. <br />Le cluster de la caroténogénèse a été récemment séquencé et identifié chez les trois bactéries étudiées. Seul le cluster de B. linens comporte un gène (orf 10) pouvant coder une hydroxylase qui présente un motif caractéristique d'un cytochrome P450, cependant son implication dans l'hydroxylation des caroténoïdes aromatiques n'est pas précisée. <br />Une série de mutagénèse aléatoire par rayonnement U.V. a été entreprise sur B. linens. Elle a permis d'obtenir un mutant noté BLMJ. Les analyses HPLC et LCMS des pigments produits par BLMJ montrent qu'il accumule très majoritairement de l'isoréniératène. Le système responsable de l'hydroxylation de l'isoréniératène de BLMJ apparaît défectueux. L'analyse de la séquence de l'ORF 10 de BLMJ révèle la présence d'une mutation au niveau de l'acide aminé 84 où la phénylalanine est remplacée par une sérine. Après comparaison avec des structures 3D de P450 connus il semblerait que cet acide aminé soit important dans la stabilisation du groupement prosthétique de l'enzyme. Sa mutation entraînerait donc une perte d'activité de l'enzyme. <br />Pour s'assurer de l'implication de l'ORF 10 dans l'hydroxylation de l'isoréniératène chez B. linens, nous avons électroporé B. linens avec l'orf 10 muté de BLMJ. Un mutant (noté BLE7J) accumulant majoritairement de l'isoréniératène a pu être isolé. L'analyse de la séquence de l'ORF 10 de BLE7J révèle la présence d'une mutation au niveau de l'acide aminé 267 où l'acide glutamique est remplacé par une glutamine. Après comparaison de séquences, il apparaît que cet acide aminé appartient à un motif conservé dans les séquences de P450 car impliqué dans la stabilisation du groupement prosthétique de l'enzyme. Sa mutation entraînerait donc une perte d'activité de l'enzyme.<br />Les mutants BLMJ et BLE7J montrent que le P450 responsable de l'hydroxylation de l'isoréniératène en 3,3'-di-hydoxy-isoréniératène est codé par l'orf 10 du cluster crt de B. linens.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00193188 |
| Date | 04 February 2005 |
| Creators | Savy, Stephanie |
| Publisher | Université de Bretagne occidentale - Brest |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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