Moluscos têm sido empregados como bioindicadores em estudos de contaminação ambiental. Nesse contexto, o caramujo de água doce Biomphalaria glabrata tem sido avaliado como um bom modelo laboratorial, e estudos prévios apontaram sua aplicação na pesquisa ambiental. A proteína HSP70 é uma molécula de 70 kDa, pertencente a uma família de proteínas com papel na manutenção da homeostase dos seres vivos: as proteínas de choque térmico (HSPs); e vem sendo estudada como potencial biomarcador de dano ambiental, indicando estresse e protegendo os organismos dos danos às proteínas. Neste trabalho, foi caracterizada a proteína HSP70 de B. glabrata pelo Western blot, com o objetivo de seu emprego em aplicações ambientais futuras. Para isso, caramujos de 5-6 meses de idade, com diâmetro de concha de 14,4 (±1,7) mm, foram expostos ao calor e ao cloreto de cádmio (CdCl2) a fim de se verificar a resposta desta proteína frente a esses estresses. Os animais foram dissecados para investigação da indução da HSP70. As proteínas foram extraídas dos tecidos com tampão RIPA, separadas em eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e detectadas com anticorpo específico para HSP70. A CL50/96h foi determinada como sendo 0,34 (0,30-0,37) ppm para o CdCl2 e serviu de referência para os experimentos de indução da proteína. Foi observado que a exposição a temperaturas subletais aumentou a resistência dos caramujos à temperatura letal de 42 °C. Exposições prévias ao calor de 33 °C e ao CdCl2 a 0,22 ppm aumentou a sobrevivência dos caramujos B. glabrata à concentração letal de CdCl2 (0,7 ppm) e à temperatura letal (42 °C), respectivamente. Os achados do Western blot apontaram para um possível papel da HSP70 nesse processo. Os resultados mostraram relação entre a proteína HSP70 e o aumento na sobrevivência aos estímulos letais após prévia exposição a estresses moderados. O Western blot mostrou uma indução da HSP70 nos grupos pré-expostos, se comparados aos grupos controles. A glândula digestiva foi o tecido mais responsivo, no que concerne à indução da proteína HSP70, comparando com tecidos de cabeça/pé e ovoteste. Foi encontrado o pico de indução da HSP70 nos caramujos B. glabrata após 48 horas de exposição ao calor de 33 °C, e após 96 horas de exposição ao CdCl2 a 0,22 ppm. Apesar do bem conhecido papel da HSP70 na termotolerância e tolerância a outros agentes estressores nos organismos vivos, esta foi a primeira vez que isto foi demonstrado no B. glabrata, oferecendo subsídios para a sua aplicação em estudos de monitoramento ambiental. Os resultados apresentados aqui abrem o caminho para estudos futuros dessa proteína no molusco, e fornecem mais bases para o conhecimento do B. glabrata. / Molluscs have been employed as bioindicators in studies of environmental stress. In this way the freshwater snail Biomphalaria glabrata has been evaluated as a good laboratory model, and previous studies have pointed for its application in environmental research. The HSP70 protein is a molecule of 70 kDa from a family of proteins with role in maintaining homeostasis: the Heat Shock Proteins (HSPs), and it has been studied as a potential biomarker for environmental injury indicating stress and providing protection against the protein damage. In this work, the protein HSP70 was characterized in B. glabrata by Western blotting aiming its employment in future environmental applications. To this purpose, 5-6 months old snails, with shell diameter of 14,4 (±1,7) mm, were exposed to heat and to cadmium chloride (CdCl2) in order to verify the response of this protein to the stresses. Animals were dissected to investigate induction of HSP70. Proteins were extracted from tissues with RIPA buffer, fractionated in denaturing polyacrilamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose membrane, and detected with a HSP70-specific antibody. The CL50/96h was determined as 0,34 (0,30-0,37) ppm for CdCl2 and served as reference in the experiments for protein induction. It was observed that exposure to sublethal temperatures improved the resistance of snails B. glabrata to the lethal temperature of 42 ºC. Previous sublethal exposure to heat at 33 °C and to CdCl2 at 0,22 ppm improved the survival of snails B. glabrata to a lethal concentration of CdCl2 (0,7 ppm) and to a lethal temperature (42 ºC), respectively. The findings of Western blot pointed to a possible role of HSP70 protein in this process. Results showed a correlation between HSP70 and the improvement of survival to lethal stimuli after a previous exposure to mild stresses. The Western blot showed an induction of HSP70 protein in the preexposed groups as compared to the control ones. The digestive gland was the most responsive tissue to stress regarding the HSP70 protein induction compared with heat/foot and ovotestis. An induction peak of HSP70 was found after 48 hours of exposure to heat at 33 °C, and after 96 hours of exposure to CdCl2 at 0,22 ppm. Despite of the well known role of HSP70 in thermotolerance and tolerance to other stress agents in living organisms, it was the first time it was shown in B. glabrata, supporting its application in environmental monitoring studies. The results presented here open a way to future studies of this protein in the mollusc, and provide more basements to knowledge of B. glabrata.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06032013-150528 |
| Date | 11 December 2012 |
| Creators | Cantinha, Rebeca da Silva |
| Contributors | Borrely, Sueli Ivone |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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