A Prolactina (PRL) é um dos hormônios mais versáteis em termos de ação biológica. Sua ação mais conhecida está relacionada com o estímulo da lactação e regulação do crescimento e da diferenciação da glândula mamária; também apresenta importante aplicação diagnóstica. Somando os crescentes estudos sobre suas possíveis aplicações terapêuticas, fica cada vez mais notória a necessidade da obtenção desse hormônio puro, biologicamente ativo e na sua forma autêntica.O objetivo fundamental desse projeto foi a produção de hPRL em escala laboratorial a partir de bactérias (E.coli) modificadas geneticamente, utilizando um sistema de expressão baseado no promotor Lambda () PL, o mesmo utilizado com sucesso em nosso laboratório na expressão do hGH. Descrevemos nesse trabalho um processo de cultivo em biorreator, onde não foi utilizado o repressor cIts, uma proteína termo-sensível que usualmente é utilizada para inibir o funcionamento do promotor PL durante crescimento a 30ºC. O processo de cultivo apresenta basicamente três etapas: na primeira etapa o crescimento é realizado sem adição contínua de nutrientes (cultivo em batch), na segunda etapa ocorre adição contínua de nutrientes e carboidrato (cultivo em fed-batch) e na última etapa é realizada a ativação, caracterizada pelo aumento da temperatura mantendo-se a adição de nutrientes e carboidrato. Esse processo de fermentação rápido e flexível, com duração média de 20 horas, permitiu obter uma biomassa final correspondente à densidade óptica de aproximadamente 30 A600nm (unidades ópticas de absorbância em 600nm) e com uma expressão da ordem de 1g de hPRL mL-1 A600 -1, as mais altas já relatadas para secreção de prolactina no espaço periplásmico. A hPRL monomérica foi purificada e caracterizada por métodos físico-químicos e biológicos, os quais confirmaram a sua atividade biológica e imunológica, o seu correto processamento e uma massa molecular relativa (Mr) de 22.906. / Prolactin (PRL) is one of the most versatile hormones in terms of biological action. His best known action is related to the stimulation of lactation and regulation of growth and differentiation of the mammary gland; it also has wide important diagnostic applications. Considering all the increasing studies on its potential therapeutic applications, the need for obtaining this hormone in its pure, biologically active and authentic form becomes clearer and clearer. The fundamental objective of this project was the production of hPRL on the laboratory scale, from genetically modified bacteria (E.coli), using an expression system based on Lambda () PL promoter, the same successfully used in our laboratory for the expression of hGH. We set up a cultivation process in bioreactor, where the repressor (cIts), a thermo-sensitive protein that is usually used to inhibit the PL promoter during the growth phase (30°C). The cultivation process presents basically three stages: the first step in was not used the growth is carried out without the continuous addition of nutrients (batch cultivation), the second step in which a continuous addition of nutrients and carbohydrate occurs (fed-batch cultivation) and a final step when activation is carried out. The latter is characterized by an increased temperature, still maintaining the addition of nutrients and carbohydrate. This fast and flexible process of fermentation, with the average duration of 20 hours, led to a final biomass of approximately 30 A600nm (units of optical absorbance at 600nm), with the expression of about 1g of hPRL mL-1A600 -1, the highest ever reported for the secretion of prolactin in the periplasmic space. Monomeric hPRL was purified and characterized by physical-chemical methods and biological assays, which confirmed its biological and immunological activity, correct processing and a relative molecular mass (Mr) of 22,906.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07072009-152955 |
| Date | 12 December 2008 |
| Creators | Oliveira, Taís Lima de |
| Contributors | Soares, Carlos Roberto Jorge |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0021 seconds