?-glucosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glucosídicas ?-1,4, ?-1,3 e ?-1,6 a partir da extremidade não redutora de oligossacarídeos de cadeias pequenas, alquil e aril ?-D-glucosídeos e dissacarídeos. Além de serem enzimas chave do complexo celulolítico, apresentam funções importantes como o melhoramento de aromas de vinhos e a hidrólise de antocianinas. Malbranchea pulchella usualmente é encontrado em fragmentos vegetais em decomposição ou material rico em celulose, podendo ser considerado promissor à produção de enzimas de interesse biotecnológico. Neste contexto, o objetivo desse projeto foi a caracterização funcional de uma ?-glucosidase de M. pulchella e sua aplicação na hidrólise de resíduos agroindustriais e de antocianinas. Uma BGL da família GH3 foi purificada com um fator de purificação 6,32 e recuperação de aproximadamente 35 %. A sua massa molecular aproximado foi de 100 kDa, e o Km, Vmáx e Kcat foram calculadas em 0,33 mM, 13,67 U/mg, 26,5 s-1 respectivamente. O dicroísmo circular revelou uma estrutura composta por aproximadamente 25% de ?-hélices e 20% de ?-folhas. A BGL apresentou pH e temperatura ótimos igual a 6,0 e 50 °C; e foi estável a 40 °C e apresentou boa estabilidade nos pH 5,0 a 8,0, por 24 horas. Nenhum dos sais de íons metálicos ativou a enzima e apenas o HgCl2 inibiu a atividade em 90%. A enzima não apresentou inibição em presença de glucose (0,1-1M) por até 24 horas. Além disso, a GH3 mostrou-se glicosilada e a proporção de açúcar corresponde a 15% massa da enzima. O efeito da celobiose (C) e do bagaço de cana-de-açúcar in natura (BCAN) na produção das BGLs foram avaliados em um DCCR, que indicou um modelo reduzido com influência das duas variáveis. A melhor condição de cultivo para a produção de BGLs foi 0,6% de C (p/v) e 4% de BCAN (p/v). Por meio de um planejamento de mistura, os resíduos BCAN, a casca de soja moída (CS) e o bagaço de cevada (BCev), foram avaliados quanto ao potencial de hidrólise a partir das enzimas presentes no extrato enzimático, resultando no maior potencial de hidrólise sobre o BCev, com a produção de aproximadamente 2 mg/mL de açúcares redutores em 48 horas. As BGLs presentes no extrato enzimático otimizado foram imobilizadas em suporte MANAE-agarose, Concanavalina A-Sepharose e BrCN-Sepharose. Os derivados BGL-MANAE e BGL-ConA foram ativados aproximadamente 10 e 3 vezes, respectivamente. BGL-MANAE e BGL-ConA foram mais estáveis que o controle BGLBrCN em todos os pH testados em 24 horas e, além disso, BGL-ConA permaneceu com 100% de sua atividade em temperaturas de 40 °C, 50 °C e 60 °C, já o BGL-MANAE mostrou-se estável a 40 °C permanecendo com 83% de sua atividade, ambos em 24 horas. BGL-MANAE e BGL-ConA apresentaram menor efeito inibitório em presença de diferentes concentrações de glucose e etanol quando comparados ao BGL-BrCN, e esses resultados indicaram que a imobilização de alguma forma colaborou para uma maior estabilidade ao pH e à temperatura, bem como ao aumento da tolerância por glucose e etanol. Os derivados puderam ser reutilizados por até 20 vezes e quando avaliados quanto à capacidade de clarificar vinhos e sucos de uva (hidrólise de antocianinas), BGL-MANAE clarificou 52% o vinho, 71% o vinho diluído, 77% o suco de uva e 56% o suco de uva diluído, e BGL-ConA em contrapartida clarificou 41% o vinho, 46% o vinho diluído, 63% o suco de uva e 23% o suco de uva diluído. BGL-MANAE foi mais eficiente que BGL-ConA na clarificação de vinhos e sucos de uva podendo ser considerado um biocatalisador promissor na hidrólise de antocianinas e, consequentemente, para a produção de vinhos brancos e rose a partir de diferentes variedades de uvas. Este trabalho pelo que sabemos, é o primeiro a usar BGLs imobilizadas com aplicação na clarificação de sucos de uva e vinhos, podendo ser considerado um trabalho inovador, e de grande importância para a indústria de alimentos e bebidas. / ?-glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of ?-1,4, ?-1,3 and ?-1,6 glucosidic linkages, from the non-reducing end of short chain oligosaccharides, alkyl and aryl ?-D-glucosides and disaccharides. Besides being complex key cellulolytic enzymes, they have important functions such as the improvement of wine flavors and anthocyanins hydrolysis. Malbranchea pulchella is usually found in decaying plant debris or in material rich in cellulose, for this reason it can be considered promising for the production of enzymes of biotechnological interest. In this context, the aim of this project was the functional characterization of a ?-glucosidase from M. pulchella and its application in the organic residues and anthocyanins hydrolysis. A BGL GH3 family produced by M. pulchella was purified with a purification factor and recovery of about 6.32 and 35 times. Its approximate molecular mass was 100 kDa, and Km, Vmax and kcat were 0.33 mM, 13.67 U/mg, 26.5 s-1, respectively. The circular dichroism revealed a structure composed of approximately 25% of ?-helix and 20% of ?-sheets. BGL presented optimum pH and temperature at 6.0 and 50 °C; and it was stable at 40 °C. It also showed good stability at pH 5.0 to 8.0, for 24 hours. None of the metal ions salts activated the enzyme and HgCl2 inhibited the activity by 90%. The enzyme showed no inhibition in the presence of glucose (0,1-1M) for 24 hours. Furthermore, it is glycosylated and the sugar proportion correspondsto 15% of the enzyme mass. The effect of cellobiose (C) and sugarcane bagasse in natura (BCAN) in the production of BGLs were evaluated in a CCRD, which indicated a reduced model of influence of the two variables. The best culture condition for BGLs production was 0.6% of C (w/v) and 4% (w/v) of BCAN. Through a mixture design, using the BCAN, ground soybean hulls (CS) and barley bagasse (BCev) were used to evaluate the potential of hydrolysis of these residues in the presence of enzymes present in the enzymatic extract, resulting in a greater efficiency of (BCev) hydrolysis, producing approximately 2 mg/mL of reducing sugars in 48 hours. The BGLs present in the optimized enzyme extract were also used in the immobilization on ionic support MANAE-agarose and affinity support Concanavalin A-Sepharose (ConA-Sepharose). The BGL-MANAE and BGL-ConA derivatives were activated approximately 10 and 3 times, respectively. BGL-MANAE and BGL-ConA were more stable than BGL-BrCN control in all pH tested within 24 hours. In addition, BGL-ConA remained 100% of its activity at 40 °C, 50 °C and 60 °C , and BGL-MANAE was stable at 40 °C and remained 83% of its activity, both in 24 hours. BGL-MANAE and BGL-ConA showed lower inhibitory effect in the presence of different glucose and ethanol concentrations when compared to BGL-BrCN and these results indicate that the immobilization, somehow, cooperated to a greater pH and temperature stability, as well as to increased tolerance by glucose and ethanol. The derivatives could be reused up to 20 times and when they were tested for their capacity to clarify wine and grape juice (anthocyanins hydrolysis), BGL-MANAE clarified 52% wine, 71% diluted wine, 77% grape juice and 56% diluted grape juice. On the other hand, BGL-ConA clarified 41% wine, 46% diluted wine, 63% grape juice and 23% diluted grape juice. BGL-MANAE was more efficient than BGL-ConA in clarifying wines and grape juices and it may be considered a promising biocatalyst in the anthocyanins hydrolysis, and consequently in the production of white and rose wines from different varieties of grapes. This work as we know, is the first to use immobilized BGLs applied in the clarification of grape juice and wine, for this reason, it can be considered an innovative work, and of great importance to the food and beverage industry
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-10012017-113644 |
| Date | 01 August 2016 |
| Creators | Lummy Maria Oliveira Monteiro |
| Contributors | Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli, Richard John Ward |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Bioquímica, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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