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Previous issue date: 2003 / A produção e a purificação de DNA plasmidial com elevado grau de pureza tem
tido um elevado interesse nos últimos anos, devido fundamentalmente aos
desenvolvimentos de técnicas de medicina molecular, como a terapia gênica e a
vacinação com DNA. O plasmídeo pD2 foi produzido em diferentes condições de
cultivo, sendo analisado várias parâmetros durante o crescimento, tais como, influência
da velocidade de agitação (120, 160 e 200 rpm), concentrações de canamicina (10, 20,
30, 40 e 50mg ml-1) e meio de cultura (Terrific Broth - TB ou Luria Bertani com glicose
- LBG). Foram também investigados o efeito da partição de DNA plasmidial, RNA e
proteínas totais nos sistemas de duas fases aquosas (SDFA) do tipo polietileno glicol
(PEG)/sal de fosfato de sódio dibásico (K2HPO4) do plasmídeo (pD2) durante o
processo de purificação. Analisou-se a influência da massa molar do PEG, massa que
carrega o sistema da solução de lise (20, 40 ou 60% m/m) na partição do plasmídeo. A
técnica de precipitação com sulfato de amônio (2,0, 2,5 e 3,0M), seguido da técnica
cromatográfica de interação hidrofóbica (CIH) utilizando como matriz estacionária o
suporte Phenyl Sepharose 6 Fast Flow foram utilizadas para purificar o plasmídeo
pVax-LacZ. A velocidade de agitação que apresentou os melhores resultados para a
produção de biomassa e DNA plasmidial foi a 200 rpm, enquanto as concentrações 30-
50mg mL-1 de canamicina apresentaram resultados semelhantes para todas as condições
estudadas. O meio de cultura TB apresentou ser o melhor em termos de produção de
DNA plasmidial e biomassa, neste meio de cultura o plasmídeo foi mais estável,
apresentando 82% de células contendo o plasmídeo. O DNA plasmidial foi particionado
entre a fase superior e inferior na dependência da massa molar do polímero constituinte
do sistema, tendo uma grande quantidade de proteína do lisado celular acumulada na
interfase dos sistemas. O melhor rendimento plasmidial (37%) foi obtido com sistema
PEG 400/K2HPO4 (20/20% m/m) carregado com 60% (m/m) de lisado celular. O
procedimento de precipitação com sulfato de amônio (2,5M) seguido da cromatografia
de interação hidrofóbica foram capazes de separar proteínas e DNA genômico do
plasmídeo, obtendo 51% de rendimento e um fator de purificação de 3,3
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/1851 |
| Date | January 2003 |
| Creators | MOREIRA, Keila Aparecida |
| Contributors | LIMA FILHO, José Luiz de |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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