Sekundäre Pflanzenstoffe zeichnen sich wegen ihrer heterogenen Zusammensetzung und großen Strukturvariabilität durch eine komplexe Pharmakokinetik aus. Wissen um die Pharmakokinetik ist wiederum für die Beurteilung von pharmakodynamischen Prozessen unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war es durch die Bestimmung wichtiger pharmakokinetischer Parameter zur Erweiterung des Verständnisses um die Verteilung von verschiedenen Bestandteilen und Metaboliten eines standardisierten Extraktes der französischen Meereskieker (pinus pinaster) im menschlichen Körper beizutragen. Es erfolgte zunächst, unter Verwendung zweier verschiedener Methoden, die Bestimmung der Plasmaproteinbindung dieser Substanzen. Hierbei fand eine affinitätschromatographische Methode mit immobilisiertem Albumin Anwendung. Die Flavonoide Taxifolin, (+)-Catechin sowie das Catechindimer Procyanidin B1 zeigten eine, aufgrund der vorliegenden Polyphenolstruktur der Substanzen gut erklärbare ausgeprägte Bindung, während für Kaffesäure, Ferulasäure und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton (Metabolit M1), das in vivo als Metabolit aus(+)-Catechin gebildet wird, eine wesentlich geringere Affinität zu Albumin ermittelt werden konnte. Desweiteren kam eine Filtrationsmethode zur Anwendung, die durch Abtrennung der Proteine aus dem Plasma eine Bestimmung der Bindung ermöglichte. Um die in Vorversuchen gezeigte ausgeprägte unspezifische Bindung der Flavonoide (+)-Catechin und Taxifolin an Membran- und Gefäßoberflächen zu minimieren wurde eine Vorbehandlung der Membranen vorgenommen. Die Resultate beider Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung, ausgenommen der bei der Ultrafiltration erhaltenen geringen Proteinbindung des Procyanidin B1. Auch die Ultrafiltrationsmethode ergab für Taxifolin und (+)-Catechin eine beinahe vollständige Bindung. Für die Phenolcarbonsäuren Ferulasäure und Kaffeesäure sowie den Metaboliten M1 hingegen ergaben sich geringere Affinitäten so dass die Ergebnisse der affinitätschromatographischen Methode bestätigt und durch die Verwendung von zwei verschiedenen unabhängigen Bestimmungsansätzen eine gesteigerte Aussagekraft der Resultate erreicht werden konnte. Eine weitere Ergänzung der Aufklärung des pharmakokinetischen Profils erfolgte durch die Ermittlung der Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und verschiedenen Blutzellen. Insbesondere für den Metaboliten M1 zeigte sich bei einigen der Versuche eine ausgeprägte Affinität zu Erythrozyten und mononukleären Zellen. Ob diesem Phänomen möglicherweise aktive Transportmechanismen zu Grunde lagen sollte durch weiterführende Betrachtungen geklärt werden. Die Untersuchungen ergaben, dass an dieser Verteilung weder ein Aminosäuretransporter noch das para-Glykoprotein beteiligt gewesen waren, jedoch ließen ergänzende Versuche den Schluss zu, dass eine erleichterte Diffusion in das Zellinnere durch den Glucose-Transporter GLUT-1 ermöglicht werden könnte. Diese Vermutung wurde durch vergleichende Energiefeld-,Oberflächen-, und Volumenberechnungen zwischen dem natürlichen Substrat des Transporters Glucose und dem Metaboliten M1 gestützt. Aufbauend auf den Ergebnissen der Verteilungsversuche wurde ein möglicher intrazellulärer Metabolismus der Substanzen in Erythrozyten und mononukleären Zellen, insbesondere durch Reaktionen des Phase II Metabolismus, untersucht. Mittels massenspektrometrischer Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bildung eines Addukts zwischen Glutathion und dem Metaboliten M1 in Erythrozyten gefunden werden. Abschließend wurde durch die Bestimmung der protektiven Eigenschaften des Metaboliten M1 gegen oxidative Schädigungen der Erythrozytenmembran auch ein pharmakodynamischer Aspekt dieser Verbindung hinzugefügt. Zwar zeigte sich bereits in einem Konzentrationsbereich von 1 μM eine ausgeprägte antioxidative Aktivität des Metaboliten M1, jedoch konnte kein Hinweis auf Beeinflussung oxidativer Membranschädigungen durch möglicherweise intrazellulär gebildete Konjugate obiger Verbindung gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten für verschiedene Bestandteile eines Kiefernrindenextraktes und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton Plasmaproteinbindungen und erstmals die Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und Blutzellen ermittelt werden. Insbesondere die in einigen Versuchen gezeigte Aufnahme bzw. Adsorption könnte einen Beitrag zur Klärung der Beobachtung liefern, dass eine deutliche Diskrepanz gefunden wurde zwischen in vivo gemessenen Plasmakonzentrationen, welche in vitro nicht ausreichend sind um deutliche Effekte auszulösen und Ergebnissen aus ex vivo Untersuchungen, die eine deutliche Beeinflussung insbesondere antiinflammatorischer Prozesse zeigten. / Secondary plant compounds are characterized by complex pharmacokinetics due to their heterogeneous composition and distinct variability of formation. Knowledge is indispensable about pharmacokinetics for estimation of pharmacodynamic effects. The objective of this thesis was to contribute to the knowledge of distribution of different constituents of a standardized French maritime pine extract (pinus pinaster) in the human body. At first two different methods were used to determine the plasma protein binding of these substances. An affinity chromatographic method using immobilized albumin was applied. The flavonoids taxifolin, (+)-catechin and the dimer procyanidin B1 revealed a pronounced binding due to their polyphenolic structures while a considerably lower affinity to albumin was found for caffeic acid, ferulic acid and δ-(3,4-dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone (metabolite M1), an in vivo formed metabolite from (+)-catechin. Additionally a filtration method was used which allowed to quantify the extent of binding by separating the proteins from the plasma. Owing to the relatively lipophilic properties of the flavonoids (+)-catechin and taxifolin membranes were pretreated to reduce the non specific binding to surfaces. The results of both methods showed good agreement, except for a lower protein binding of procyanidin B1 observed by the ultrafiltration method. Taxifolin and (+)-catechin displayed almost complete protein binding in the affinity chromatography and the ultrafiltration method. For the phenolic acids ferulic acid, caffeic acid and the metabolite M1, however, there was lower affinity and these results were consistend with the data obtained by affinity chromatography confirming the validity of the results. Further investigations regarding the pharmacokinetic profile included determining the distribution of these substances between plasma and blood cells. Particularly a pronounced binding of the metabolite M1 to erythrocytes and mononuclear cells was found. Whether an active transport underlied this phenomenon mechanisms should be clarified by further investigations. The experiments showed that this distribution was neither influenced by amino acid transporters nor that the para glycoprotein was involved. But based on additional testing it was concluded that a facilitated diffusion of M1 was mediated by the glucose transporter GLUT-1. This assumption was supported by comparative force field, surface and volume calculations between the natural substrate of the transporter glucose and the metabolite M1. A potential intracellular phase II metabolism of the compounds in erythrocytes and mononuclear cells was examined based on the results of partition experiments. Mass spectrometric investigations revealed an adduct formation between glutathione and the metabolite M1 in human erythrocytes. Finally, by determining the protective properties of the metabolite M1 against oxidative damage of erythrocyte membrane, a pharmacodynamic aspect of this compound was added. Strong antioxidant activity occurred for the metabolite M1 already in a concentration range of 1 μM. However, obviously any intracellulary formed glutathione metabolite did not contribute to this effect. Within the scope of this work the first time plasma protein binding and the distribution between plasma and blood cells were determined for different compounds and a metabolite of a maritime pine extract. Especially the uptake of the compounds into blood cells might contribute to explain the observation that a significant discrepancy is found between in vivo measured and antiinflammatorily effective plasma concentrations and the fact that these concentrations are not sufficient to trigger significant effects in vitro.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:4970 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Kurlbaum, Max |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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