Over the past decades, Fourier Transform Infrared (FTIR) microspectroscopy has emerged as a potential candidate to complement Histopathology in the study and diagnosis of tissue diseases. Contrary to the histological examination, which relies on the morphological tissue alterations assessed by visual inspection of stained samples, FTIR chemical imaging is a rapid and label-free tool that provide simultaneously information about histological structures as well as the localisation and magnitude of basic molecular units that compose tissue sections (proteins, nucleic acids, lipids, and carbohydrates). Despite the many proof-of-concept studies demonstrating the effectiveness of FTIR spectroscopy in detecting biological disorders with high levels of sensitivity and specificity, translation into clinical practice has been relatively slow due to the substantial cost of infrared transparent substrates required to collect the images. Thus, the main objective of this research is to evaluate the diagnostic potential of infrared chemical images collected from samples placed on conventional histology glass slides as alternative substrates for FTIR spectroscopy. Swiss mice were submitted to a well-established chemical carcinogenesis protocol, in which cancerous and non-cancerous cutaneous lesions were obtained by varying the exposure time of the animals to carcinogenenic factors. FTIR hyperspectral images were acquired in transmission mode over the mid-infrared region from tissue specimens placed on conventional infrared substrates (calcium fluoride - CaF2) and glass slides. In the first phase of our study, spectral datasets were segmented using k-means (KMCA) and Hierarchical Cluster Analysis (HCA) as clustering algorithms to reconstruct the hyperspectral images aiming to evaluate the ability of the false-color maps in reproducing the histological structures of tissue specimens. The images were segmented by each clustering technique using several different combinations varying parameters including the substrate used to place the samples (CaF2 or conventional glass) and the methods employed to preprocess the datasets. Fingerprint (1000-1800 cm-1) and high wavenumber (3100-4000 cm-1) regions from images collected on CaF2 were separately used as input for image reconstruction and only the high wavenumber range was employed in the case of samples placed on glass. All pseudocolor maps were compared to standard histopathology in order to evaluate the quality and consistency of images after segmentation. KMCA presented slightly superior ability in correctly assigning the pixels of morphochemical maps to the histological structures of the specimen, nevertheless, our findings indicate that the choice of the substrate, input data, preprocessing methods, and sample preparation have more influence in the final results than the clustering algorithm used to reconstruct the images. In the second phase of our study, Principal Component Analysis (PCA) was employed to compare datasets from healthy group to animals exposed to chemicals for 8, 16, and 48 weeks in order to evaluate the biochemical changes induced by chemical carcinogenesis. The performance of classification in each pairwise comparison was calculated using a binary classification test based on Linear Discriminant Analysis associated to PCA (PC-LDA). The method achieved satisfactory discrimination (over 80%) comparing healthy tissue to samples that were classified as papilloma (16 weeks) and invasive squamous cell carcinoma (48 weeks) regardless of the substrate used to place the samples. Statistical measurements obtained comparing healthy skin to animals exposed to carcinogenic factors for 8 weeks (free of malignancy based on the morphological and clinical evidence) ranged from 35-78%, indicating that the ability of PC-LDA in correctly classifying spectral data from cancerous and pre-cancerous lesions vary with the stage of the disease during the tumorigenesis process. Thus, as a proof-of-concept, we demonstrate the feasibility of FTIR spectroscopy in evaluating the biological events triggered by cancer using a label-free methodology that do not rely on expensive substrates and do not disrupt the pathologist workflow. This is a major step forward towards clinical application, since the method can be used to complement the diagnostic process of cancer as a non-subjective alternative that do not require laborious and time-consuming procedures nor expensive probes as biomarkers. / Nas últimas décadas, a microespectroscopia de absorção no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) tem surgido como potencial ferramenta para complementar a Histopatologia no estudo e diagnóstico de doenças teciduais. Ao contrário do exame histológico, que se baseia na inspeção visual de amostras coradas visando avaliar as alterações morfológicas que as doenças ocasionam no tecido, o imageamento químico obtido pela técnica de FTIR baseia-se nas características bioquímicas da amostra sem o uso de colorações. Apesar da vasta literatura comprovando a eficácia da espectroscopia FTIR em detectar alterações biológicas causadas por doenças com altos níveis de sensibilidade e especificidade, a implementação do método na prática clínica tem sido relativamente lenta devido ao alto custo dos substratos transparentes no infravermelho que são necessários para aquisição de dados. Diante disso, o objetivo principal do presente trabalho é avaliar a capacidade diagnóstica de imagens hiperespectrais coletadas de amostras em lâminas de vidro como substratos alternativos para a espectroscopia FTIR. Camundongos Swiss foram submetidos a um protocolo de carcinogênese química, no qual lesões cutâneas cancerosas e não-cancerosas foram obtidas variando-se o tempo de exposição dos animais aos fatores carcinogênicos. Imagens hiperespectrais FTIR foram adquiridas no modo de transmissão na região do infravermelho médio a partir de amostras de tecido depositadas em substratos transparentes no infravermelho (fluoreto de cálcio - CaF2) e vidro convencional. Na primeira fase de nosso estudo, os dados espectrais foram segmentados usando as técnicas estatísticas k-means (KMCA) e Análise Hierárquica de Clusters (HCA) como algoritmos de agrupamento para reconstruir as imagens hiperespectrais com o objetivo de avaliar a capacidade dos mapas de cores falsas em reproduzir as estruturas histológicas das amostras de tecido. As imagens foram segmentadas por cada técnica de agrupamento variando-se o substrato usado para colocar as amostras (CaF2 ou vidro convencional) assim como os métodos de tratamento utilizados para pré-processamento dos dados. As regiões de impressão digital (1000-1800 cm-1) e de altos números de onda (3100-4000 cm-1) das imagens coletadas em CaF2 foram usadas separadamente como dados de entrada para a reconstrução das imagens, enquanto apenas a faixa de altos números de onda foi utilizada no caso de amostras colocadas em vidro. Ao fim do processo de segmentação os mapas de cores falsas obtidos foram comparados com a Histopatologia padrão a fim de avaliar a qualidade e consistência das imagens. Os resultados obtidos pela técnica de KMCA foram ligeiramente superiores com relação a HCA na identificação de pixels dos mapas morfo-quimicos correspondentes às estruturas histológicas da amostra. No entanto, nossos achados indicam que a escolha do substrato, dados de entrada, métodos de pré-processamento e preparação de amostras têm mais influência nos resultados finais do que o algoritmo de agrupamento usado para reconstruir as imagens. Na segunda fase do nosso estudo, a Análise de Componentes Principais (PCA) foi empregada para comparar os dados do grupo saudável aos animais expostos aos produtos carcinogênicos por 8, 16 e 48 semanas a fim de avaliar as alterações bioquímicas induzidas pela carcinogênese química. O desempenho da classificação em cada comparação pareada foi calculado usando um teste de classificação binária baseado na Análise de Discriminante Linear associada à técnica de PCA (PC-LDA). O método obteve discriminação satisfatória (acima de 80%) comparando tecido saudável com as amostras que foram classificadas como papiloma (16 semanas) e carcinoma espinocelular invasivo (48 semanas) independentemente do substrato usado para colocar as amostras. A comparação de pele saudável com animais expostos aos fatores carcinogênicos por 8 semanas (livres de malignidade de acordo com as evidências clínicas e morfológicas) apresentou figuras de performance cujos valores variaram entre 35-78%, indicando que a habilidade da técnica de PC-LDA em classificar corretamente dados espectrais de lesões cancerosas e pré-cancerosas variam com o estádio da doença durante o processo de tumorigênese. Diante disso, como uma prova de conceito, demonstramos a viabilidade da espectroscopia FTIR na avaliação dos eventos biológicos desencadeados pelo câncer usando uma metodologia que não requer colorações e substratos caros, assim como não interrompe/altera o fluxo de trabalho atual do patologista. Este é um passo importante na implementação da tecnologia no ambiente clínico, uma vez que o método pode ser usado para complementar o processo de diagnóstico do câncer como uma alternativa não-subjetiva e que não requer procedimentos trabalhosos e demorados, nem sondas caras como biomarcadores.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05062019-155251 |
| Date | 26 April 2019 |
| Creators | Lima, Cássio Aparecido |
| Contributors | Zezell, Denise Maria |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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