Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global do fungo aquático Blastocladiella emersonii submetido ao estresse de carência de oxigênio (hipóxia), utilizando a técnica de microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3773 genes distintos. Nos experimentos de hipóxia gradual (diminuição gradual da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) e hipóxia direta (diminuição direta da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) observamos que 650 genes foram diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições de estresse e que 534 deles mostraram-se afetados (direta ou indiretamente) pela disponibilidade de oxigênio, uma vez que apresentaram recuperação (ou tendência à recuperação) da sua expressão aos níveis normais, quando as células foram reoxigenadas. Além de modular a expressão de diversos genes sem função conhecida, B. emersonii responde à hipóxia reajustando a expressão de genes responsáveis pela produção e consumo de energia. Pelo menos transcricionalmente, este fungo favorece o metabolismo anaeróbico, através da indução de genes que codificam enzimas da via glicolítica e lactato desidrogenase, ao passo que no ciclo do ácido cítrico, a maioria dos genes encontram-se reprimidos ou não sofrem alteração na expressão. Processos dispendiosos em energia como síntese protéica, metabolismo de aminoácidos, enovelamento de proteínas e transporte por membrana apresentaram perfis predominantemente de repressão gênica quando em carência de oxigênio. Ainda utilizando a técnica de microarranjos, mostramos semelhanças entre os perfis transcricionais nos experimentos hipóxia e de carência de Fe2+ (tratamento com quelante de Fe2+ 2,2´-dipyridyl) sugerem que estes estresses estão de alguma forma relacionados, fornecendo bons indícios de que o íon Fe2+ possa ter um papel importante no mecanismo sensor de oxigênio e/ou de resposta a hipóxia em B. emersonii. Além disso, o tratamento prévio de células submetidas à hipóxia com o antibiótico geldanamicina, um conhecido inibidor da proteína de choque térmico HSP90, levou à diminuição da indução de certos genes de hipóxia, indicando que este fungo pode possuir algum mecanismo semelhante ao do fator de transcrição de hipóxia HIF1-α de mamíferos, uma vez que este fator também é afetado por geldanamicina. Adicionalmente, desenvolvemos um protocolo para transformação de B. emersonii mediada por Agrobacterium tumefasciens que se mostrou promissor. A transferência do T-DNA contendo um gene de resistência a higromicina B, presente no vetor binário pBINPLUS-Hph, foi evidenciada pelo crescimento normal e esporulação das células transformadas, na presença do antibiótico e pela amplificação do gene de resistência no DNA genômico de células transformadas. / In this work we analyzed global gene expression changes in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii submitted to oxygen deprivation (hypoxia), using cDNA microarrays containing 3,773 distinct genes. In gradual hypoxia (gradual decrease in dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) and direct hypoxia (direct decrease of dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) we observed 650 differentially expressed genes in at least one of the stress conditions tested, 534 of them being affected (directly or indirectly) by oxygen availability, since they showed recovery of normal expression levels or a tendency to recover, when cells were reoxygenated. Besides modulating many genes with no previously assigned function, B. emersonii responds to hypoxia by readjusting the expression levels of genes responsible for energy production and consumption. At least transcriptionally, this fungus seems to favour anaerobic metabolism through the induction of genes encoding glycolytic enzymes and lactate dehydrogenase, while in the TCA-cycle, most genes were repressed or unchanged. Energy-costly processes like protein synthesis, amino acid metabolism, protein folding and transport had their gene expression profiles predominantly repressed during oxygen deprivation. Microarray experiments also showed similarities between the transcriptional profile of genes in hypoxia and iron (II) deprivation (treatment with the iron (II) chelator 2,2\'-dipyridyl), suggesting that these stresses are somehow related, giving good evidence that Fe2+ ion could have a role in the mechanism of oxygen sensing and/or response to hypoxia in B. emersonii. Furthermore, pretreatment of cells subjected to hypoxia with the antibiotic geldanamycin, a known inhibitor of the heat shock protein HSP90, caused a significant decrease in the induction of certain hypoxic genes, indicating that this fungus could have a mechanism similar to that of the mammalian hypoxia transcription factor HIF-1α, which is also affected by geldanamycin. Additionally, we developed an Agrobacterium tumefasciens-mediated protocol for transformation of B. emersonii that has shown to be promising. The capacity to transfer the T-DNA containing a hygromycin B resistance gene, present in the pBINPLUSHph binary vector, was evidenced by the normal growth and sporulation of the transformed cells in the presence of antibiotic and by amplification of the resistance gene from the genomic DNA of transformed cells
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-28042010-082547 |
| Date | 16 December 2009 |
| Creators | Camilo, Cesar Moisés |
| Contributors | Gomes, Suely Lopes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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