A aflatoxina B1 (AFB1) é um metabólito de fungos do gênero Aspergillus que crescem naturalmente em alimentos. Devido às condições climáticas e às práticas agrícolas inadequadas, países em desenvolvimento, incluindo o Brasil, possuem alta possibilidade de exposição à AFB1 através de alimentos contaminados. A exposição crônica a essa micotoxina pode acarretar no surgimento de carcinoma hepatocelular e explicar a incidência desse tumor na ausência de fatores como hepatites virais e cirrose. Após a ingestão oral, a AFB1 é biotransformada para a sua forma genotóxica que se liga ao DNA das células hepáticas. Isso gera mutações que podem ser consideradas promotoras da hepatocarcinogênese. Na sequência desse processo, ocorre a formação de novos adutos de aflatoxina que podem se ligar à proteína plasmática ou serem excretados pela urina, respectivamente, AFB1-lisina e AFB1-N7-guanina. Esses compostos podem ser detectados e funcionar como biomarcadores da exposição e da toxicidade da AFB1. A AFB1 foi administrada enteralmente em ratos Wistar, via gavagem, durante 90 dias, sendo essa forma de exposição a mais próxima daquela pela qual os seres humanos estão suceptíveis. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: Grupo Controle (sem AFB1), AFB50 (50 ppb), AFB100 (100 ppb) e AFB200 (200 ppb), sendo a concentração de AFB1 em parte por bilhão (ppb) por kilograma de dieta consumida. Foram realizadas avaliações de bioquímica plasmática de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT); alterações na expressão hepática de genes e proteínas relacionadas ao processo de hepatocarcinogênese (Ciclina D1, p53, ?-catenina, Proibitina, p27Kip1 e Glutationa-S-Transferase-p1-GSTP) por meios das técnicas de imuno-histoquímica e PCR em tempo real. Foram realizadas determinações dos níveis dos adutos da AFB1 no soro, na urina. Os resultados mostraram que houve aumento na expressão de AST e ALT em todos os grupos que receberam AFB1. No grupo AFB200 e, em menor proporção no AFB100, surgiram diversos focos de hepatócitos alterados marcados positivamente com GSTP, que são lesões pré-neoplásicas bem determinadas e consideradas endpoints em ensaios de hepatocarcinogênese experimental. A análise das proteínas hepáticas indicou que as lesões decorrentes da AFB1 nos grupos AFB200 e AFB100 apresentaram superexpressão de ciclina D1, p53, ?-catenina, proibitina, indicando a participação delas em vias que favorecem a hepatocarcinogênese. Adicionalmente, ocorreu uma redução na expressão gênica do gene p27, o que também indica uma condição favorável para a progressão neoplásica para a formação de carcinoma hepatocelular. A quantificação dos níveis de adutos no soro e na urina apontou que a formação desses compostos foi dose-dependente com as diferentes concentrações de AFB1 empregadas. Além disso, houve correlação entre a formação dos adutos com a expressão das proteínas Ciclina D, p53, ?-catenina e Rb. Sendo assim, foi possível, experimentalmente, apontar as principais proteínas envolvidas na hepatocarcinogênese e indicar que os adutos de aflatoxina no soro e na urina podem ser biomarcadores úteis para mensurar a exposição e o dano causado pela ingestão subcrônica de AFB1. / Aflatoxin B1 (AFB1) is metabolite produced by fungi of genus Aspergillus that grows naturally in food. Due to weather conditions and inadequate agricultural practices, developing countries, including Brazil, have high possibility of exposure to AFB1- contamined food. Chronic exposure to this mycotoxin may result in the emergence of hepatocellular carcinoma and explain the incidence of this tumor in the absence of factors such viral hepatitis and cirrhosis. After oral ingestion, AFB1 is biotransformed to its genotoxic form that binds to DNA in liver cells. This leads mutations that may be considered promoters of hepatocarcinogenesis. Following this process, there is the formation of new adducts of aflatoxins that can bind to plasma proteins or are excreted in the urine, respectively, AFB1-lysine and AFB1-N7-guanine. These compounds can be detected and work as biomarkers of exposure and toxicity of AFB1. AFB1 was administered in Wistar rats enterally, via gavage, for 90 days, and this form of exposure is closest which humans are susceptible. The animals were separated into four groups: control group (without AFB1), AFB50 (50 ppb), AFB100 (100 ppb) and AFB200 (200 ppb), in which concentration of AFB1 in part per billion (ppb) per kilogram of diet consumed by animals. It were performed liver biochemistry plasma aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) assessments; changes in hepatic expression of genes and proteins related to hepatocarcinogenesis (Cyclin D1, p53, ?-catenin, Prohibitin, p27Kip1 e Glutatione-STransferase-p1-GST-P) by immunohistochemical and real-time PCR techniques. The levels of AFB1 adducts of serum and urine were performed. The results showed increase in AST and ALT levels in all groups receiving AFB1. In group AFB200 and, lesser extent in AFB100, emerged several altered hepatocyte foci positively marked with GST-P, which are well determined preneoplastic lesions and deemed endpoints in experimental hepatocarcinogenesis assays. Analysis of liver proteins indicated that damage from AFB1 in groups AFB200 and AFB100 showed overexpression of cyclin D1, p53, ?-catenin, prohibitin, indicating their participation in ways that favor the hepatocarcinogenesis. Additionally, there was a decrease in gene expression of the p27 gene, which also indicates a favorable condition for neoplastic progression to hepatocellular carcinoma. Quantification of adducts levels in serum and urine showed that the formation of these compounds was dose-dependent with different concentrations of AFB1 employed. In addition, there was a correlation between the formation of adducts with the protein expression of Cyclin D, p53, ?-catenin and Rb. Thus, it was possible experimentally to point out the key proteins involved in hepatocarcinogenesis and indicate that aflatoxin adducts in serum and urine can be useful biomarkers to measure exposure and damage caused by subchronic ingestion of AFB1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06012017-145306 |
| Date | 22 August 2016 |
| Creators | Trotta, Mauricio de Rosa |
| Contributors | Ramalho, Fernando Silva |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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