A lectina ArtinM, extraída de sementes de Artocarpus heterophyllus e caracterizada como um homotetrâmero constituído de subunidades de 16 kDa, tem alta afinidade de ligação a manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, que constitui o core de N-glicanas. ArtinM é dotada de interessantes propriedades biológicas: (1) ativa neutrófilos a partir do reconhecimento de N-glicanas dos receptores CXCR2 e TLR2; (2) induz a desgranulação de mastócitos por interagir com N-glicanas de Fc?R ou com N-glicanas de IgE ligadas a Fc?R; (3) estimula a produção de IL-12, por reconhecer N-glicanas contidas no ectodomínio de TLR2 da superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs); (4) exerce atividade imunomoduladora, que direciona o padrão de resposta para o perfil Th1; (5) confere resistência a infecções por patógenos intracelulares, como Paracoccidioides brasiliensis, Leishmania amazonensis e Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans Células T CD4+ participam de funções essenciais do sistema imune; durante o estabelecimento de uma resposta imune, podem ser desenvolvidas subpopulações de células T CD4+ adequadas para gerar respostas eficientes de combate a patógenos, manutenção da tolerância e regulação da imunidade. A ativação das células T CD4+ depende de um primeiro sinal, desencadeado pelo complexo TCR/CD3, e de um segundo sinal, oriundo de moléculas coestimulatórias como CD28. A ativação e expansão de células T CD4+ são limitadas pela ação de moléculas inibitórias, principalmente por CTLA-4. Lectinas podem ativar as células T, sendo a fitohemaglutinina (PHA) e a Concanavalin A (ConA) os exemplos mais conhecidos. Além disso, está bem caracterizado que o alvo de reconhecimento de ConA localiza-se no complexo TCR/CD3. No presente estudo buscou-se caracterizar os efeitos da lectina ArtinM sobre células T CD4+ murinas e investigar os possíveis mecanismos responsáveis pelos efeitos exercidos. Foram avaliados, inicialmente, os efeitos diretos de ArtinM sobre as células T CD4+, no que se refere à produção de citocinas, expressão de moléculas coestimulatórias e inibitórias e indução de diferenciação celular. Passou-se então à identificação de possíveis receptores de superfície reconhecidos por ArtinM e responsáveis pelo desencadeamento da ativação celular. Finalmente, buscou-se apontar moléculas sinalizadoras envolvidas nos efeitos diretos de ArtinM. A primeira evidência da interação direta de ArtinM com células T CD4+ foi proporcionada por aglutinação celular. Uma curva dose-resposta revelou que 5µg/ml foi a melhor concentração para adquirir significativa produção de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-?) e Th17 (IL-6 e IL-17A) pelas células T CD4+. O estímulo com a concentração ótima de ArtinM mostrou que após 12 horas de incubação houve um significativo aumento nos níveis de IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A no sobrenadante celular; persistindo no curso de 48 horas de observação. A secreção concomitante de IFN-? e IL-17A motivou a avaliação, por citometria de fluxo, da ocorrência de dupla marcação intracelular dessas citocinas. O estímulo, por 24 horas, com ArtinM, levou a importante aumento da frequência de células duplo-positivas para IFN-? e IL-17. Uma vez comprovado pelo padrão de citocinas secretadas que ArtinM promove a ativação das células T CD4+, investigou-se a expressão das moléculas CD25 e CTLA-4. ArtinM aumentou a expressão de ambas as moléculas, de maneira dose-dependente. Curiosamente, a detecção tanto de CD28, como de CTLA-4, foi precoce e persistente, diferindo do padrão temporal de expressão proporcionado por outros ativadores de células T CD4+. Com vistas a determinar o mecanismo através do qual ArtinM atua nas células T CD4+, alvos potenciais de reconhecimento foram ensaiados: CD3?, CD3??, CD28, CD45 e CD4. Esses receptores foram selecionados com base em predição de potenciais sítios Nglicosilados. Dessa forma, anticorpos específicos para essas moléculas foram utilizados para analisar a sua capacidade de inibir a atividade de ArtinM de induzir as células T CD4+ a produzir citocinas, como IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A. Apenas o anticorpo anti-CD3?? foi capaz de impedir a secreção das citocinas induzidas por ArtinM. Além disso, esse anticorpo inibiu a marcação de células T CD4+ por ArtinM biotinilada. Esses dados indicam que ArtinM exerce sua atividade sobre células T CD4+ através do reconhecimento de glicanas na cadeia ? do receptor CD3, não excluindo-se, entretanto, a ocorrência da interação de ArtinM com outras glicoproteínas na superfície de linfócitos T CD4+. Também foi verificado que ArtinM possui alta especificidade por glicanas na superfície dessas células, pois foram necessárias elevadas concentrações de manotriose para inibir em 50% a ligação de ArtinM à superfície das células T CD4+. Através do uso de inibidores específicos para moléculas sinalizadoras, constatou-se que PI3K, PTK, p42/44MAPK, p38MAPK, JNK e PKC estão implicadas na sinalização para a produção das citocinas de perfis Th1 e Th17, induzida por ArtinM. Esse conjunto de resultados indica que ArtinM é um potente e rápido ativador de células T CD4+. A ativação celular induzida por ArtinM está relacionada com a ligação à cadeia ? do receptor CD3 e se associa à alta expressão de moléculas coestimuladoras e inibitórias. Ademais, demonstrou-se que ArtinM promove a diferenciação das células T CD4+ naive em células Th1 e Th17, utilizando moléculas sinalizadoras que são conhecidas como críticas para a indução de citocinas que caracterizam essas subpopulações celulares. / The lectin ArtinM, extracted from seeds of Artocarpus heterophyllus and characterized as a homotetramer consisted of 16 kDa subunits, has high binding affinity to the manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, which is the core of N-glycans. ArtinM is endowed with interesting biological properties: (1) it activates neutrophils through the recognition of Nglycans attached to CXCR2 and TLR2 receptors; (2) induces degranulation of mast cells by interacting with N-glycans of Fc?R or to N-glycans of IgE bound to Fc?R; (3) stimulates the production of IL-12 through the recognition of N-glycans of the TLR2 ectodomain, expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs); (4) exerts immunomodulatory activity, which accounts for Th1 immunity (5) confers resistance to intracellular pathogens, such as P. brasiliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans. CD4+ T cells participate in essential functions of the immune system. During the development of an immune response, CD4+ T cells are activated and give origin to subpopulations of cells that are suitable for establishing effective responses to combat pathogens, for tolerance maintenance, and for adequate immuneregulation. The activation of CD4+ T cells depends on a first signal, triggered by the TCR/CD3 complex, and a second signal, provided by costimulatory molecules. The activation and expansion of CD4+ T cells is limited by the action of inhibitory molecules. Lectins may activate T cells, and Phytohemagglutinin (PHA) and Concanavalin A (ConA) are the best know examples. Furthermore, it is well characterized that the target for ConA recognition is localized in the TCR/CD3 complex. The present study was delineated to characterize the effects of the lectin ArtinM on murine CD4+ T cells and to investigate the possible mechanisms accounting for the observed effects. It was investigated the ArtinM direct effects on CD4+ T cells, concerning its ability to induce the production of cytokines, the expression of costimulatory and inhibitory molecules and cell differentiation. In addition, the possible surface receptors recognized by ArtinM and responsible for triggering cell activation were also assessed. Finally, signaling molecules involved in the direct effects of ArtinM were approached. The first evidence of direct interaction of ArtinM with CD4+ T cells was provided by cell agglutination. A dose-response curve has revealed that 5µg/ml was the best ArtinM concentration to achieve significant production of Th1 (IL-2 and IFN-?) and Th17 (IL-6 and IL-17A) cytokines by TCD4+ cells. Stimulus with the optimum ArtinM concentration has showed that after 12 hours incubation there was a significant augmentation of IL-2, IFN-?, IL- 6 and IL-17A levels in the cell supernatant; which has persisted in the course of 48 hours observation. The concomitant secretion of IFN-? and IL-17A led us to evaluate, by flow cytometry, the intracellular expression of these cytokines. After 24 hours stimulation with ArtinM, there was a significant increase in the frequency of cells IFN-?+IL-17+. Once the cytokines detection indicated that CD4+ T cells have been activated by ArtinM, the expression of CD25 and CTLA-4 molecules was assessed. ArtinM increased the expression of both molecules, in a dose-dependent manner. Interestingly, both cell surface molecules, CD25 and CTLA-4, were early and persistently detected a temporal pattern that is distinct from the provided by other inducers of CD4+ T cell activation. In order to determine the mechanism by which ArtinM acts on CD4+ T cells, potential targets of recognition were assessed: CD3??, CD3?, CD28, CD45 and CD4. These receptors were selected on the basis of prediction of N-glycosylation sites. Specific antibodies for these molecules were assayed regarding their ability to inhibit the ArtinM of inducing TCD4+ cells to produce cytokines, such as IL-2, IFN-?, IL-6 and IL-17A. Only anti-CD3 antibody was able to prevent the cytokines secretion induced by ArtinM. In addition, anti-CD3 antibody has inhibited the T CD4+ cell labeling by biotynil-ArtinM. These data indicate that ArtinM exerts its biological activity on T CD4+ cells through recognition of CD3 receptor ? chain glycans, without excluding the occurrence of ArtinM interactions with other glycoproteins on the surface of T CD4+ lymphocytes. The interaction of ArtinM with glycans at the surface of these cells was found to occur with great specificity, since high concentrations of the manotriose - Man? 1-3 [Man? 1-6] Man - were required to inhibit the binding. By using specific inhibitors of signaling molecules, we have found that PI3K, PTK and p42/44MAPK are relevant cytokine production profiles of Th1 and Th17 cells after stimulation with ArtinM. All toghether, these results indicate that ArtinM is a potent and rapid activator of CD4+ T cells. The activation induced by ArtinM is triggered by its binding to the CD3 receptor ? chain, which induces high expression of costimulator and inhibitory molecules. Moreover, it was demonstrated that ArtinM promotes the differentiation of naive CD4+ T cells into Th1 and Th17 cells by committing signaling molecules that are known as critical for the induction of cytokines that characterize these subpopulations of cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31082016-114033 |
| Date | 05 April 2012 |
| Creators | Silva, Thiago Aparecido da |
| Contributors | Barreira, Maria Cristina Roque Antunes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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