Le réseau de protéines chaperons est hautement conservé dans l'ensemble du vivant. Il régule l'homéostasie des protéines au sein de la cellule en condition de croissance normale ainsi qu'en réponse à des stress environnementaux. Les chaperons membres de la famille HSP70 (Heat Shock Protein 70 kDa), famille particulièrement conservée, agissent tout au long de la biogénèse des protéines et orchestrent une pléthore de processus cellulaires liés au repliement et/ou au remodelage de protéines. Le cycle ATP-dépendant du chaperon HSP70 repose sur une étroite collaboration avec ses partenaires co-chaperons. Parmi ces co-chaperons, on distingue les membres de la famille DnaJ/HSP40 qui transfèrent les substrats vers HSP70 et stimulent son activité ATPasique, et les facteurs d'échange de nucléotides qui assurent la réinitialisation du cycle d'HSP70 permettant ainsi la libération du substrat. Au sein de la bactérie E. coli, la protéine HSP70 est appelée DnaK. Elle agit de concert avec les deux co-chaperons DnaJ et GrpE (ensemble nommés DnaKJE) afin d'assister les protéines dans leur repliement au cours de la synthèse de novo, de désagréger des protéines mal repliées, de faciliter l'adressage et le passage de protéines à travers les membranes biologiques, et de remodeler certains complexes protéiques impliqués dans des processus cellulaires variés. DnaKJE coopère efficacement avec d'autres systèmes chaperons majeurs, tels que la protéine Trigger Factor (TF) associée aux ribosomes et le complexe chaperonine GroESL, notamment pour le repliement de protéines nouvellement synthétisées dans le cytosol. De plus, une des fonctions cellulaires majeure du système DnaKJE est son implication dans la réponse au stress thermique (Heat Shock Response - HSR). DnaKJE contrôle la HSR en interagissant directement avec le facteur de transcription s32, sous-unité de l'ARN polymérase. Cette interaction facilite la dégradation de s32 par la protéase FtsH. En condition de stress, l'accumulation de protéines mal repliées au sein de la cellule entraine le recrutement de DnaKJE et par conséquent, la stabilisation de s32. Suite à cette stabilisation, une induction de la transcription de plus d'une centaine de gènes codant entre autres, pour des protéines chaperons et des protéases se met en place dans la cellule pour lutter contre le stress environnant. De ce fait, DnaK et ses co-chaperons sont considérés comme des éléments clés de la réponse cellulaire contre le collapse de l'homéostasie protéique par action directe sur des protéines mal repliées et indirecte en modulant la synthèse de nombreuses HSPs, via s32. L'étude récente de l'intéractome de DnaK révèle qu'au moins 50% des enzymes impliquées au sein du métabolisme central (MC) de la cellule interagissent avec DnaK à température physiologique. A travers l'analyse d'une banque de suppresseurs multi-copie, nous avons identifié six gènes associés au MC : ackA, ldhA, lpd, pykF, talB et csrC qui lorsqu'ils sont surexprimés, permettent de restaurer partiellement le défaut de croissance d'une souche mutante n'exprimant pas les chaperons DnaK et Trigger Factor (deltatig deltadnaKJ). Remarquablement, la surexpression d'ackA, talB et csrC supprime également le défaut de croissance d'un mutant dnaK à haute température, ce qui suggère une implication importante de DnaK au niveau du MC. Dans ce projet, l'implication de DnaK dans le fonctionnement du métabolisme carboné a été établi par une analyse métabolique combinant analyses macro-cinétiques (suivi de croissance, analyse de la consommation des substrats et de la production de produits du métabolisme) sur différentes sources de carbones seules ou en mélange et analyses micro-cinétiques (flux métaboliques par marquage 13C). Finalement, ces travaux apportent différentes hypothèses quant au rôle de DnaK dans le contrôle du MC, directement ou indirectement via la régulation de la HSR, en réponse à une défaillance de l'homéostasie protéique ou d'une carence nutritionnelle. / Intricate networks of highly conserved molecular chaperone machines govern cellular protein homeostasis, both under lenient and more stressful growth conditions. Members of the highly conserved HSP70 family of molecular chaperones are key players in this process, acting at nearly every step in protein biogenesis. The ATP-dependent chaperone cycle of HSP70 chaperones relies upon the cooperation with a cohort of essential cochaperones, including DnaJ/HSP40 family members that recruit the chaperone to specific substrate and/or cellular localization and stimulate its ATPase activity, and nucleotide exchange factors, which insure proper resetting of the chaperone cycle and the resulting substrate release. In the bacterium Escherichia coli, the multifunctional HSP70 chaperone, named DnaK, acts in concert with its cochaperones DnaJ and GrpE (all together referred as DnaKJE) to efficiently, assist de novo protein folding, protein disaggregation, protein targeting and translocation through biological membranes, and protein complexes remodeling leading to multiple cellular activities. Remarkably, previous works also showed that DnaKJE can efficiently cooperate with other major cytosolic chaperones, including the ribosome-bound Trigger Factor (TF) and the chaperonin GroESL, especially during the folding of newly-synthesized cytosolic proteins. In addition, one of the key cellular functions of DnaKJE in E. coli is the regulation of the heat shock response (HSR). In this case, DnaKJE controls the HSR by interacting directly with the heat shock sigma factor s32 subunit of the RNA polymerase to facilitate it degradation by the FtsH protease. Under stress condition, DnaKJE is recruited to accumulating misfolded proteins, leading to an increased stability of s32 and the subsequent induction of more than hundred heat shock proteins. Therefore, DnaK, and its cochaperones are central components of the cellular response to proteostasis collapse, both by acting directly on misfolded proteins and by modulating the synthesis a plethora of heat shock chaperones and proteases. The recently described in vivo interactome of DnaK in E. coli revealed that at least 50% of the central metabolism enzymes interact with DnaK at physiological temperature. Remarkably, through a multicopy suppression analysis we have now identified six genes of the central metabolism (CM), namely ackA, ldhA, lpd, pykF, talB and csrC, which when overexpressed partially suppress the growth defect of the sensitive double mutant lacking DnaK and Trigger Factor (deltatig deltadnaKJ ), with half of them, namely ackA, talB and csrC, additionally suppressing the growth defect of the single ?dnaKJ mutation at high temperature, thus strongly suggesting a major role of DnaK in this process. Using a combination of growth assays on specific carbon sources entering the CM at various metabolic nodes with NMR analyses for characterizing the carbon source assimilation, identifying and quantifying the metabolism by-products and determining metabolic flux rearrangements, we show that DnaKJE impacts the responsiveness of the central metabolism by acting either directly at the level of the CM or along the first step of substrate assimilation. How does the multifunctional DnaK chaperone modulate the CM, either directly or indirectly via the control of the HSR, in response to proteostasis failure or nutrient starvation is discussed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015TOU30126 |
| Date | 09 October 2015 |
| Creators | Anglès, Frédéric |
| Contributors | Toulouse 3, Genevaux, Pierre, Letisse, Fabien |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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