Unter den Techniken der chemischen Proteomik hat Capture Compound – Massenspektrometrie (CCMS) den Vorteil, Interaktionen von Molekülen mit geringer Affinität zueinander effektiv untersuchen zu können. CCMS beruht auf kleinen molekularen Sonden (Capture Compounds, CCs), die aus drei funktionalen Bestandteilen bestehen: die Selektivitätsfunktion, ist ein kleines Molekül, das mit einem Zielprotein eine schwache Wechselwirkung eingeht. Die zweite Funktionalität erlaubt kovalente Anhaftung der molekularen Sonde an Proteine. Der dritte Anteil erlaubt Detektion mit sehr guten Sensitivität; allerdings ist die Quantifizierung weiterhin ein Schwachpunkt dieser Technik.
Ziel dieses Projektes ist, eine in CCMS verwendbare Quantifizierungsmethode zu entwickeln. Heutzutage gibt es zahlreiche MS-basierte Quantifizierungsstrategien; unsere beruht auf der Einführung von Lanthanoid-haltigen Labels – Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT).
In dieser Arbeit wurde erstmalig die erfolgreiche Verwendung mit Metall- Markern chemoproteomischer Sonden (CCs) zur Detektion und absoluten Quantifizierung von Zielproteinen mit schwacher Wechselwirkung etabliert. Mit den Experimenten an isolierten Enzymen und an lebenden Zellen wurde nachgewiesen, dass Metall-Marker keinen negativen Einfluss auf andere funktionelle Teile chemoproteomischer Sonden haben. CCs, die mit Lanthanoid-Chelaten funktionalisiert sind, zeigen ähnliche Affinität zu ihren Zielproteinen wie die Referenz-Sonden. Zudem erlauben Metall-Marker, die für diese Art molekularer Sonden verwendet werden, die Entwicklung einer element-basierten Technik zur Bilderzeugung. Der herausragende Vorteil der Metall-funktionalisierten CCs kombiniert mit ICP-MS ist, dass diese eine absolute Quantifizierung der Ausbeute der Quervernetzungen ermöglichen. / Capture compound mass spectrometry (CCMS) is a chemical proteomics technique that has the advantage of addressing low abundant target proteins in lysates as well as in living cells. The CCMS is based on small molecule probes (capture compounds) that consist of three functionalities: a small molecule (quite often it is a drug), which interacts with the target protein; the moiety that allows covalent attachment of the molecular probe to the protein; the one that allows detection. The detection moiety utilized for CCMS can offer high sensitivity; however, the challenge of absolute quantification is still a bottleneck of this technique.
Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT) is a quantitative approach based on the chemical labeling with lanthanide; it allows obtaining both the structural and quantitative information.
In this work for the first time the successful utilization of chemoproteomic probes functionalized with a metal tag for the detection and absolute quantification of target proteins was established. With the experiments both on isolated enzymes and living cells it was determined that MeCAT does not negatively influence other functional parts of the probes; therefore, capture compounds functionalized with lanthanide chelates demonstrate similar affinity to the target as the reference probes. Moreover, metal tags utilized for this type of molecular probes can offer a promising elemental imaging technique. However, to achieve the sufficient resolution multiple metal tags per molecular probe are needed. The striking advantage of the approach of utilization metal functionalized capture compound combined with ICP-MS detection is that it allows absolute quantification of crosslink yield, what cannot be performed with other detection methods applied for this technology.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/19590 |
| Date | 01 March 2018 |
| Creators | Kuzmich, Oleksandra |
| Contributors | Linscheid, Michael, Köster, Hubert, Weller, Michael |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY 3.0 DE) Namensnennung 3.0 Deutschland, http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/ |
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