Glykosidhydrolaser (GHs) är enzymer som katalyserar hydrolys av glykosidbindningar i polysackarider och fungerar på endo- eller exo-sätt, beroende på om de riktar sig mot mitten eller änden av en glykan-kedja. De är viktiga i kolcykeln och i olika industrier som använder biomassa som substrat. GHs är fördelaktiga i många industriella processer på grund av deras höga specificitet, omsättningsgrad och biologiska nedbrytbarhet, men de kan vara instabila och är ofta dyra att producera. De varierar i specificitet och har ibland flera katalytiska domäner eller icke-katalytiska tillbehörsdomäner, vilket hjälper till att bryta ner polysackarider och/eller främjar enzymets livslängd. Många GHs kan ha kolhydratbindande moduler (CBMs) som ökar deras termostabilitet och/eller katalytiska aktivitet. CBMs är kopplade till andra domäner i multimodulära domäner av inter-domän länkar (IDLs), vilket är polypeptidkedjor som ger strukturell flexibilitet och låter CBMs nå önskade mål på ett substrat, men den fulla funktionen av IDLs i enzymstabilisering har inte dokumenterats. Kitinaser är en grupp av GHs som riktar sig mot det motsträviga polysackaridet kitin, vilket finns i både marina och markbundna miljöer. De finns i organismer såsom insekter med kitinhaltiga exoskelett och i svampar eller andra mikrober med kitininnehållande cellväggar, men de finns även i organismer som inte syntetiserar eller ens metaboliserar kitin, på grund av deras andra relevanta funktioner inom patogenicitet, immunförsvar, etc. Kitin och dess oligosackarid-derivat har flera funktioner i biomass-industrier och kan användas för medicinska ändamål. Många GHs innehåller icke-katalytiska CBMs, varav många är kitinbindande, och spelar därför en roll i att främja kitinbindning och hydrolys av deras enzympartners. Detta projekt fokuserar på ett modulärt GH18-kitinas kodat av genen Cpin_2580. Kitinasdomänen är flankerad av två CBMs. Tidigare forskning har visat att dessa inte är kitinbindande men föreslog att de påverkar enzymets termostabilitet. Däremot undersöktes inte IDL:ernas påverkan i den tidigare studien. För att bestämma rollen av IDLs designades primers för att klona nya genvarianter av Cpin_2580 för att producera nya proteiner med varierande längder av länkar för att bestämma vad för effekt längden har på enzymets termostabilitet. Dessa primers användes till PCR för att skapa gensekvenser med den befintliga Cpin_2580-18s-plasmiden som mall, följt av kloning, proteinproduktion, rening och analys med hjälp av fluoroforbindningsanalys. Nya proteinvarianter kunde genereras och produceras i liten skala, men produktionen upplevde problem, vilket ledde till att IDLs roll inte kunde fastställas fullt ut. / Glycoside hydrolases (GHs) are enzymes that catalyse the hydrolysis of glycosidic bonds in polysaccharides, functioning in endo- or exo-manners, depending on whether they target the middle or the end of a glycan chain. They are crucial in the carbon cycle and various industries that utilise biomass as substrate. GHs are advantageous in many industrial processes due to their high specificity, turnover rates, and biodegradability, but they can be unstable and are often costly to produce. They vary in specificity and sometimes carry multiple catalytic domains or non-catalytic accessory domains, aiding in polysaccharide breakdown and/or promoting the longevity of the enzyme. Many GHs can have carbohydrate binding modules (CBMs) attached that can be considered accessory domains, which increases their thermostability and/or catalytic activity in many cases. CBMs are attached to other domains in multi-modular enzymes by inter-domain linkers (IDLs), which are polypeptide chains that give structural flexibility and allow the CBMs to reach desired targets on a substrate, but the full function of IDLs in enzyme stabilisation has not been documented. Chitinases are a group of GHs that targets the recalcitrant polysaccharide chitin, which exists in both marine and terrestrial environments. They exist in organisms such as insects that have chitinous exoskeletons and in fungi or other microbes with chitin-containing cell walls, but they are also found in organisms that do not synthesise or even metabolise chitin, due to their other functions of relevance in pathogenicity, immune defence, etc. Chitin and its oligosaccharide derivatives have multiple functions in biomass industries, and can be used for medical purposes. Many chitinases contain non-catalytic CBMs, many of which are often chitin-binding, and therefore have a role in promoting chitin attachment and hydrolysis by their enzyme partners. This project focuses on a modular GH18 chitinase encoded by the gene Cpin_2580. The chitinase domain is flanked by two CBMs. Previous research has shown that these are not chitin-binding but suggested they do influence the thermostability of the enzyme. However, the impact of the IDLs was not explored in that previous study. To determine the role of the IDLs, primers were designed with the purpose of cloning new gene variants of the gene Cpin_2580 to produce novel proteins with varying lengths of linkers to determine the effect the length has on the thermostability of the enzyme. These primers were used for PCR to create novel gene sequences using the pre-existing Cpin_2580-18s plasmid as a template, followed by cloning, protein production, purification, and analysis using fluorophore binding assay. Novel protein variants could be generated and produced at small scale, but scaled-up protein production experienced problems, which led to the role of IDLs not being fully determined.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-348001 |
| Date | January 2024 |
| Creators | Estreen, Erik |
| Publisher | KTH, Glykovetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2024:200 |
Page generated in 0.0025 seconds