Chez les trypanosomatidés, on observe un double cycle cellulaire : karyokinèse et cytodiérèse sont synchronisées mais indépendantes. La membrane nucléaire persiste au cours de la mitose dite fermée. Les modalités de réplication de l'ADN et de sa régulation, de même que plusieurs étapes de la ségrégation des chromosomes, restent non élucidées : le kinétochore est composé de protéines très atypiques (KKTs), et il existe un déficit du nombre de kinétochores par rapport au nombre de chromosomes. D'autre part, la constitution des pôles du fuseau mitotique associés à la membrane nucléaire est totalement inconnue. Les nucléoporines sont des protéines conservées au cours de l'évolution, principalement impliquées dans la constitution des pores nucléaires et le trafic entre le noyau et le cytoplasme, mais également de plus en plus considérées comme des acteurs importants de la dynamique chromatinienne. En utilisant des vecteurs d'expression protéique sous forme fusionnée à la GFP, nous avons déterminé la localisation subcellulaire de 15 nucléoporines chez Leishmania major. Si la plupart de ces nucléoporines se localisent à la membrane nucléaire, plusieurs d'entre elles ont des localisations secondaires qui peuvent être prédominantes. Ainsi la nucléoporine Mlp2 est préférentiellement localisée au niveau du kinétochore et, en fin de mitose, à l'extrémité du fuseau mitotique chez les deux parasites Leishmania major et Trypanosoma brucei. En accord avec la localisation de TbMlp2 au kinétochore chez T. brucei, où les centromères sont identifiés, nous avons fréquemment détecté TbMlp2 à proximité des séquences centromériques, elles-mêmes détectées par FISH en périphérie du nucléole. Egalement grâce à la technique de FISH, nous montrons que l'inhibition de l'expression de TbMlp2 par ARN-interférence perturbe la distribution des chromosomes au cours de la mitose, conduisant à une aneuploïdie. Paradoxalement, cette inhibition n'a aucun effet sur la croissance des cellules. Nous présentons également le cas singulier de Mlp1, dont la localisation chez T. brucei dépend du site d'intégration choisi. Cette localisation sera discutée à la lumière des phénotypes observés lors de l'inhibition de son expression. / Trypanosomatid parasites exhibit two independent though coordinated (nuclear and mitochondrial) cell cycles, and a closed mitosis, of which many constituents and processes are unknown. In particular, most steps of the chromosome segregation remain elusive: the kinetochore is composed of atypical proteins called KKT and the number of kinetochores is deficient in relation to the number of chromosomes. Moreover, the constitution of the nuclear membrane-associated mitotic spindle poles is unknown. Nucleoporins are evolutionary conserved proteins mainly involved in the constitution of the nuclear pores and trafficking between the nucleus and cytoplasm, but are also increasingly viewed as main actors in chromatin dynamics. Using GFP-fused proteins, we determined the cellular localization of the 15 nucleoporins in Leishmania major. If most of these nucleoporins localized at the nuclear membrane, some of them exhibited secondary locations which are predominant in a few cases. Thus, the nucleoporin Mlp2 localized preferentially at the kinetochore and, at the end of mitosis, at the mitotic spindle poles in both parasites Leishmania major and Trypanosoma brucei. Consistent with the localisation of TbMlp2 to the kinetochore in T. brucei, where centromeres are identified, TbMlp2 was frequently detected in the vicinity of the centromeric sequences in the periphery of the nucleolus. The use of FISH allowed us to show that RNAi knockdowns of TbMlp2 disturbed the distribution of chromosomes during mitosis, leading to aneuploidy. Paradoxically RNAi knockdowns of TbMlp2 had no effect on cell growth. We will also present the singular case of Mlp1 whose location is dependent on the integration site in T. brucei. This location will be discussed in the light of the phenotypes observed after inhibition of its expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015MONTT026 |
| Date | 11 September 2015 |
| Creators | Morelle, Christelle |
| Contributors | Montpellier, Bastien, Patrick, Pagès, Michel |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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