Since its discovery in 1928, Raman spectroscopy (RS) has produced a revolution in the fields of analytical chemistry and molecular detection. Thanks to the latest technical advances, the expectations of the applicability of RS in biology have increased. Most recently, RS emerged as an important candidate technology to detect and monitor the evolution of the biochemical content in biomedical samples non-invasively and with high specificity. However, the inherent properties of Raman scattering have limited its full exploitation for biomedical applications. In the past decade, Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) and multivariate analysis have emerged as possible solutions for overcoming the low efficiency and the complexity of the Raman signals obtained from biological material. Until 2009, only a few studies had been reported using multivariate approaches, and these techniques were only employed to group different types of samples. Moreover, although the SERS effect was demonstrated for cells, SERS probes were not used in their full capacity to study complex biological
processes inside cells.
This thesis is a step towards combining and using statistical analysis and SERS to expand the applicability of RS in biochemistry: from single molecule to cell and tissue level. This mehtodology could reveal novel insights, otherwise inaccessible using previous techniques.
Specifically, we began studying the changes in Raman spectra of a single DNA molecule and a RBC under stretching employing optical tweezers. SERS and statistical techniques such as 2D correlation and PCA were used to reveal important structural properties of those biological materials.
An experiment to study intracellular pH changes in glioma cells after Photodynamic Treatment (PDT) was performed by using SERS probes embedded in the cells. The evolution in the SERS spectra was analyzed using 2D correlation. To the best of our knowledge, this study represents the first use of the 2D correlation technique to study cellular SERS spectra. Furthermore, more complex systems were investigated, to reveal the molecular evolution of cells or tissues undergoing a biochemical process. PCA was used to study how lipid metabolism varied in different breast cancer cell lines depending on the degree of malignancy. However, PCA does not provide meaningful components that could be assigned directly to molecular Raman spectra. Consequently, Multivariate Curve Resolution (MCR) was proposed and applied to extract physically and chemically meaningful molecular components that changed in cancer cells during the Epithelial to
Mesenchymal transition (EMT). We monitored the retina composition ex-vivo when neuroinflammation was induced. Our study was the first application of MCR to decompose and monitor the molecular content of biological tissue with RS. Biomarkers for the early detection of neuroinflammation processes were identified and monitored. This is the first step in establising of a non-invasive and rapid screening technique for the early detection of multiple sclerosis or other neurodegenerative diseases in patients.
Finally, the flexibility of MCR-ALS algorithm was exploited to remove the presence of background signals in Raman spectra of cytological studies that mask and degrade the results of a statistical analysis. Application of MCR-ALS enabled identification of molecular components that play an important role in the progression of breast cancer cells towards bone metastasis.
This research demonstrated a powerful method that adds a new dimension to the field of analytical chemistry. Sensitive and highly specific information can be extracted non-invasively, rapidly, and without sample preparation. The samples can be monitored in vivo, quantifying molecular components difficult or impossible to obtain with current technology. / Desde que se descubrió la espectroscopia de Raman (ER) en 1928, esta técnica ha producido una revolución en el área de química analítica. Gracias a los últimos avances técnicos, las expectativas de aplicar ER en biomedicina han aumentado. La posibilidad de detectar y monitorizar la evolución del contenido bioquímico en muestras biomédicas de forma no invasiva con alta especificidad se ha convertido en una visión a perseguir. Sin embargo, las propiedades inherentes a la dispersión Raman han inhibido su completa explotación para aplicaciones biomédicas. En la última década, Surface Enhanced Raman spectroscopy (SERS) y el análisis multivariante se han erigido como posibles soluciones para superar la baja eficiencia y la complejidad de las señales Raman de material biológico. Hasta 2009, estas técnicas no habían sido explotadas para su uso en aplicaciones biomédicas.
La presente tesis representa un paso hacia la combinación y el uso de análisis estadísticos y SERS para expandir la aplicabilidad de la ER en bioquímica: desde moléculas individuales hasta células y tejidos. Nuevos descubrimientos inaccesibles a técnicas bioquímicas usadas habitualmente, se han podido revelar con esta metodología.
En concreto, empezamos estudiando cambios en el espectro Raman de una molécula individual de ADN y un glóbulo rojo (RBC) sometidos a diferentes estiramientos por medio de pinzas ópticas. Se han utilizado SERS y técnicas estadísticas como correlación 2D (2DC) y Análisis de Componentes Principales (PCA) para revelar importantes propiedades estructurales de esos materiales biológicos.
Se realizó un experimento para estudiar los cambios de pH intracelulares en células gliales después del tratamiento fotodinámico (PDT) utilizando sondas SERS implantadas en el interior de las células. La evolución del espectro SERS fue analizado utilizando 2DC. Hasta donde sabemos, este estudio representa el primer uso de la técnica 2DC para estudiar espectros SERS celulares.
Además, se han investigado sistemas más complejos para revelar la evolución molecular de células y tejidos a lo largo de un proceso bioquímico. Con este objetivo, se utilizó el PCA para estudiar el metabolismo lipídico en diferentes líneas celulares de cáncer de mama relacionándolo con su grado de malignidad. No obstante, el PCA no proporciona componentes significativos que podrían ser asignados directamente a espectros moleculares Raman. En consecuencia, se propuso la Multivariate Curve Resolution (MCR) para extraer componentes moleculares con significado físico y químico que cambiaban en las células cancerígenas durante la transición epitelio-mesenquima (EMT).
En otra aplicación, se monitorizó la composición de la retina ex-vivo cuando se inducía una neuroinflamación. Nuestro estudio representaba la primera aplicación de MCR para descomponer y monitorizar el contenido molecular de un tejido biológico con ER. Se identificaron biomarcadores para la detección precoz de procesos neuroinflamatorios. Esto representa el primer paso hacia el establecimiento de una técnica no-invasiva y de diagnostico temprano de esclerosis múltiple u otras enfermedades neurodegenerativas en pacientes.
Finalmente, se explotó la flexibilidad del algoritmo MCR-ALS para eliminar la presencia de ruido de fondo en el espectro de Raman para estudios citológicos que enmascaran y degradan los resultados del análisis estadístico. Gracias a eso, se pudieron identificar nuevos componentes moleculares que ejercían un papel muy importante en la progresión de células de cáncer de mama hacia la metástasis ósea.
Esta investigación ha revelado un potente método que añade una nueva dimensión al campo de la química analítica. Se ha podido extraer información con alta especificidad y sensibilidad de forma no invasiva, rápida y sin preparación especial de la muestra. Las muestras pueden ser monitorizadas in vivo, cuantificando sus componentes moleculares difíciles o imposibles de extraer con la tecnología actual.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UPC/oai:www.tdx.cat:10803/129447 |
| Date | 12 July 2013 |
| Creators | Marro Sánchez, Mònica |
| Contributors | Petrov, Dimitri, Universitat Politècnica de Catalunya. Institut de Ciències Fotòniques |
| Publisher | Universitat Politècnica de Catalunya |
| Source Sets | Universitat Politècnica de Catalunya |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 208 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/es/ |
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