A conclusão do seqüênciamento do genoma de múltiplos vertebrados trouxe um importante desafio para entender e predizer função, particularmente para seqüências não-codificantes, a partir de seqüências primarias de DNA. A hipótese de que a conservação evolutiva prediz seqüências funcionais é comumente aceita, inclusive para seqüências envolvidas na regulação da transcrição gênica, mesmo que a conservação de seqüências tenha gerado imperfeitas predições de enhancers (acentuadores) funcionais. O colágeno tipo XVIII é um componente da maioria das membranas basais; mutações no gene COL18A1 levam a síndrome de Knobloch, uma doença autossômica recessiva caracterizada por degeneração vitreoretiniana e macular e encefalocele occipital. O COL18A1 tem 43 exons que transcrevem três isoformas a partir de dois promotores diferentes. As três isoformas apresentam um complexo modelo de expressão tecido-específico, incluindo expressão em rim, pulmão, cérebro e retina. Os níveis de expressão do COL18A1 são considerados clinicamente importantes na vasculogenese, e em predisposição para o hepatocarcinoma e diabetes tipo 2. Dessa forma, a identificação de regiões regulatórias fornecerá indícios sobre a regulação da expressão do COL18A1 em estados normal e patogênico. Além disso, a endostatina e o FRZC18 são fragmentos proteolíticos do colágeno XVIII envolvidos na sinalização Wnt. No entanto, o papel in vivo do FRZC18 ainda não foi estudado. Uma profunda investigação do papel deste domínio na via de sinalização Wnt é indubitavelmente necessária, bem como a compreensão da regulação do COL18A1 pela via de Wnt. Empregamos um sistema eficiente de teste em zebrafish para analisar o potencial funcional de elementos enhancers na regulação transcricional do COL18A1. Identificamos quatro elementos enhancers que controlam a transcrição consistente com o COL18A1 endógeno de zebrafish, em tecidos incluindo retina, rim, vasos sanguíneos, intestino, cartilagem e fígado. Apesar dos algoritmos utilizados não tenham detectado conservação em seqüências não-codificantes de humanos à teleósteos no lócus do COL18A1 estudado, as seqüências humanas funcionaram apropriadamente em zebrafish transgênicos. Adicionais análises computacionais post hoc revelaram similaridade entre seqüência humana e de zebrafish dentro ou próximo das quatro regiões enhancers. Testamos funcionalmente o FRZC18 com superexpressão de seu RNAm em embriões de zebrafish. Este experimento resultou em embriões com fenótipos que assemelharam à mutantes da via não-canônica de Wnt (slb e ppt). Este resultado aponta o FRZC18 como um antagonista da via de sinalização não-canônica de Wnt, possivelmente por interação com Wnt11 e Wnt5. Dissecamos o promotor 1 do COL18A1, o qual mostrou características de genes housekeeping e similaridades com o promotor 2 do COL18A1. Também mostramos possível ligação de TCF/LEF aos promotores do COL18A1. A via de Wnt levou à redução de atividade dos promotores do COL18A1 e também redução dos níveis de expressão através de superexpressão de β-catenina. Este trabalho elucidou de forma geral, os elementos regulatórios em cis do COL18A1 e melhor caracterizou o seu papel na via de sinalização Wnt como um antagonista também da via não-canônica e como um alvo da via canônica. / The completion of multiple vertebrate genome sequences has presented an important challenge to understand and predict function from primary DNA sequence, particularly for noncoding sequence. It is commonly hypothesized that evolutionary conservation predicts functional DNA sequences, including those involved in regulating gene transcription, although sequence conservation has proven to be an imperfect predictor of enhancer function. Type XVIII collagen is a component of most basement membranes; mutations in the COL18A1 gene lead to Knobloch Syndrome, an autosomal recessive disease characterized by vitreoretinal and macular degeneration and occipital encephalocele. COL18A1 has 43 exons that transcribe three isoforms from two different promoters. The three isoforms display complex patterns of tissue-specific expression, including in kidney, lung, brain, and retina. Expression levels of COL18A1 are thought to be clinically important in vasculogenesis, and in predisposition to hepatocarcinoma and diabetes type 2. Therefore, identification of the regulatory regions will provide insight into normal and pathogenic regulation of COL18A1 expression. Furthermore, endostatin and FRZC18 are cleaved fragments from collagen XVIII that are involved in Wnt signaling, however in vivo role of FRZC18 has not been investigated yet in any model organism. Thus, a deeper investigation of FRZC18 role in Wnt signaling is indubitable necessary, as well as a comprehension of COL18A1 regulation by Wnt signaling. We have employed an efficient system of transgenesis in the zebrafish to functionally evaluate potential enhancer elements regulating COL18A1 transcription. We identified four enhancer elements that control transcription consistent with zebrafish endogenous COL18A1, in tissues including retina, kidney, blood vessels, gut, cartilage and liver. Although the algorithms we used did not detect noncoding conservation from human to teleosts at the COL18A1 locus, the human sequences functioned appropriately in zebrafish transgenics. Additional post hoc computational analysis revealed detectable sequence similarities between human and zebrafish in or near two of the four enhancer regions. We tested one of these zebrafish regions and confirmed orthologous enhancer activity. We functionally tested FRZC18 with its mRNA overexpression in zebrafish embryos. This experiment resulted in embryos with phenotype remaining slb and ppt, mutants of non-canonical wnt components. This result points FRZC18 as an antagonist of non-canonincal Wnt signaling possibly by interaction with Wnt11 and Wnt5. We dissected COL18A1 promoter 1 and it showed characteristics of a housekeeping gene and similarities with promoter 2 and we also showed possible TCF/LEF binding to COL18A1 promoters. Wnt signaling responded to downregulate promoter activity of COL18A1 and also decrease its expression by overexpression of s-catenin. This work broadly elucidated COL18A1 cis regulatory elements and better characterized its role in Wnt signaling as an antagonist of noncanonical and also as a target of canonial signaling.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-28102009-144108 |
| Date | 19 June 2009 |
| Creators | Erika Kague |
| Contributors | Maria Rita dos Santos e Passos Bueno, Luiz Paulo Moura Andrioli, Andrea Laurato Sertie Santos, Luis Eduardo Soares Netto, José Xavier Neto |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Biologia Genética), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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