During mitotic spindle assembly, γ-tubulin ring complexes (γTuRCs) nucleate
microtubules at the centrosome, around mitotic chromatin and, by augmindependent
recruitment, from pre-existing microtubules. The analysis of these
distinct pathways in somatic cells is challenging due to the predominance of
centrosomal nucleation. It is also unknown how microtubules derived from different
nucleation pathways are organized into the bipolar spindle structure. Minus ends
were shown to be present throughout the spindle with a higher concentration near
the poles. However, the analysis of minus end dynamics has been prevented by
lack of a suitable probe.
I have identified the γ-tubulin ring complex (γTuRC) as a reliable marker for noncentrosomal
microtubule minus ends in the spindle and have confirmed the
accumulation of minus ends in the pole-proximal region. Using cells stably
expressing γ-tubulin fused to photoactivatable GFP and mutants of γTuRC
subunits, I have demonstrated that the γTuRC is recruited preferentially in the poledistal
spindle region, where it associates with microtubule minus ends and then
moves poleward along the mitotic spindle. Poleward transport of γTuRC at minus
ends depends on the molecular motors dynein, KIFC1 and KIF11. I also
discovered that some of the γTuRC that reaches the poles is stably incorporated at
the centrosomes, complementing the microtubule-independent centrosome
targeting previously described.
Using laser ablation of centrosomes, I studied non-centrosomal spindle assembly.
At mitotic entry, in the absence of centrosomes, these cells could nucleate
microtubules from the nuclear area. These microtubules formed multipolar spindles
but cells eventually divided into two daughter cells. However, cells derived from
these abnormal mitoses were typically not viable.
In summary, by revealing the dynamics of the minus ends of non-centrosomal
microtubules, I have provided novel insight into assembly and architecture of the
mitotic spindle. In addition, I have shown that centrosomes, even though not
essential for somatic cell division, play an important role in the fidelity of spindle
assembly and function. / Durante la formación del huso mitótico, los complejos anulares de γ-tubulina
(γTuRCs, del ingles γ-tubulin ring complexes) nuclean microtúbulos alrededor de
la cromatina mitótica y, mediante la interacción con el complejo de la Augmina, a
partir de otros microtúbulos ya existentes. El estudio de estos mecanismos en
células somáticas es complejo, debido a la predominancia de la nucleación
centrosomal de los microtúbulos en estas células. En la actualidad, aun no se
sabe como microtúbulos procedentes de distintas vías de nucleación se
organizan en la estructura bipolar del huso mitótico.
Se ha observado que los extremos (-) están presentes a lo largo del huso,
detectándose una mayor concentración cerca de los polos. A pesar de esto, no
se conocen estudios detallados acerca de la dinámica del extremo (-) debido a la
ausencia de marcadores adecuados.
He observado que el complejo anular de γ-tubulina (γTuRC) es un marcador
fiable de los extremos (-) en los microtúbulos acentrosomales presentes en el
huso mitótico. Además, he confirmado la acumulación de estos extremos (-) en
la región próxima a los polos del huso.
Utilizando líneas celulares que expresan de forma estable γ-tubulina fusionada a
un GFP foto-activable, y que además han sido transfectadas con isoformas
mutantes de subunidades del γTuRC, he demostrado que el γTuRC se recluta
preferentemente en regiones del huso alejadas de los polos. Allí el γTuRC se
asocia con los extremos (-) de los microtúbulos, para ser transportado a lo largo
del huso mitótico en dirección a los polos.
El transporte del γTuRC presente en los extremos (-) en dirección a los polos lo
realizan los motores moleculares Dineina, KIFC1 y KIF11. También he
descubierto que una parte de las moléculas de γTuRC que alcanzan los polos
del huso se integran de forma estable en los centrosomas, complementando la
vía de incorporación al centrosoma independiente de microtúbulos que ha sido
previamente descrita.
Usando la técnica de ablación de centrosomas con laser, he estudiado la
formación acentrosomal del huso. Cuando estas células entran en mitosis en
ausencia de centrosomas, pueden nuclear microtúbulos desde el área nuclear.
Estos microtúbulos forman husos multipolares, aunque las células finalmente se
dividen en dos células hijas. Las células procedentes de estas mitosis anormales
no suelen ser viables.
En conclusión, mediante el revelado la dinámica de los extremos (-) de los
microtúbulos no centrosomales, he proporcionado nueva información acerca del
ensamblaje y arquitectura del huso mitótico. Además, he demostrado que los
centrosomas, aunque no son esenciales para la división celular somática, juegan
un papel importante en el correcto ensamblaje y función del huso mitótico.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UPF/oai:www.tdx.cat:10803/299799 |
| Date | 10 April 2014 |
| Creators | Lecland, Nicolas, 1984- |
| Contributors | Lüders, Jens, Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut |
| Publisher | Universitat Pompeu Fabra |
| Source Sets | Universitat Pompeu Fabra |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 134 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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